RESUMEN

Los mecanismos de resistencia a fluconazol en Candida albicans incluyen alteraciones en la enzima diana (lanosterol 14-a-desmetilasa) y sobreexpresión de transportadores activos de membrana que disminuyen la concentración intracelular de los azoles. Aunque el porcentaje de resistencia al fluconazol en aislamientos de C. albicans procedentes de infecciones sistémicas se mantiene pequeño, en la candidiasis orofaríngea en pacientes con sida constituye un grave problema. Para poder establecer la prevalencia de la resistencia al fluconazol en este caso, se han investigado los mecanismos moleculares de resistencia a los azoles en aislamientos de C. albicans resistentes al fluconazol (CMI �64 mg/l) procedentes de pacientes VIH positivos con candidiasis orofaríngea. Las pruebas de sensibilidad se llevaron a cabo según las normas del NCCLS. La identificación de los aislamientos se realizó empleando técnicas de tipificación de DNA. La sobreexpresión de los genes que codifican para la enzima lanosterol 14-a-desmetilasa (erg11) y para los transportadores de membrana (mdr1 y cdr) se monitorizó por comparación con aislamientos isogénicos sensibles. Asimismo, los genes erg11 fueron amplificados por PCR y secuenciados para la detección de mutaciones concretas. La resistencia al fluconazol en estos aislamientos se debía a la combinación de diferentes mecanismos moleculares de resistencia. El carácter multifactorial de la resistencia de C. albicans a los azoles existentes hace necesario adoptar nuevas estrategias para combatirla, como son el desarrollo de moléculas más potentes, la investigación de nuevos antifúngicos con nuevas dianas y mecanismos de acción, así como combinaciones con inhibidores de los transportadores activos de membrana.

Palabras clave: Candida albicans - Fluconazol - Transportadores - Genes erg11

Azole resistance in Candida albicans

SUMMARY

The molecular mechanisms of azole resistance in Candida albicans include alterations in the target enzyme (lanosterol 14-demethylase) and overexpression of efflux transporters that decrease the intracellular concentration of the drug. Although the rate of azole resistance in systemic isolates of C. albicans remains very low, resistance to fluconazole appears as an important issue in the management of oropharyngeal candidiasis (OPC) in patients with AIDS. In order to establish the prevalence of resistance to azole antifungal agents in this setting, we investigated the molecular mechanisms of resistance to azoles in highly resistant C. albicans isolates (fluconazole MIC 64 mg/l) from HIV-infected patients with OPC. Antifungal susceptibility testing of serial C. albicans isolates was performed by NCCLS methodology. Strain identity was investigated by DNA-typing techniques. Overexpression of genes encoding lanosterol 14-demethylase (erg11) and efflux transporters (mdr1 and cdr) implicated in the development of resistance was monitored in matched sets of susceptible and resistant isolates. In addition, erg11 genes were PCR-amplified and their nucleotide sequences determined in order to detect point mutations. A combination of different mechanisms of resistance contributed to the development of resistance to fluconazole. The multifactorial character of the azole resistance in C. albicans makes necessary the development of approaches to overcome the problem. Accordingly, new triazoles have been developed; new classes of antifungals are being investigated; and combinations with inhibitors of efflux transporters are being studied.

Key words: Candida albicans - Fluconazole - erg11 genes

C. albicans es un hongo dimórfico que puede actuar como comensal o como patógeno oportunista en el hombre. Entre los factores que predisponen al padecimiento de candidiasis figuran los tratamientos inmunosupresores y quimioterápicos, la presencia de catéteres intravenosos, bajo peso al nacer, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), diabetes y drogadicción, entre otros. Dependiendo del estado inmunitario del paciente, dicho microorganismo puede producir una amplia gama de afecciones, desde candidiasis orofaríngea hasta infecciones diseminadas. La falta de pruebas diagnósticas fiables, el limitado arsenal terapéutico disponible y la elevada toxicidad de algunos de los tratamientos empleados son la causa de la inaceptable alta tasa de mortalidad asociada a la infección diseminada (1).

Los pacientes VIH positivos desarrollan con frecuencia candidiasis orofaríngea. Candida spp. coloniza la mucosa oral del 64% al 84% de estos enfermos, causando enfermedad sintomática hasta en el 46% de ellos (2). El tratamiento con azoles, especialmente fluconazol, ha demostrado ser eficaz tanto in vitro como en estudios clínicos frente a C. albicans, siendo considerado de elección en la candidiasis orofaríngea (3-6). El fluconazol inhibe la síntesis del ergosterol mediante la unión a la enzima 14-a-esterol desmetilasa dependiente del citocromo P-450, impidiendo con ello la conversión del lanosterol en ergosterol. La depleción del ergosterol celular, junto a la acumulación de ciertos compuestos intermedios en su síntesis, lleva en última instancia a una pérdida de la funcionalidad de la membrana plasmática, produciendo un efecto fungistático (7). En el caso de los pacientes con sida, que presentan episodios recurrentes de candidiasis orofaríngea, la resistencia al fluconazol y a otros azoles se esta convirtiendo en un grave problema clínico. La prevalencia de resistencia a los azoles se ha estimado en un 21% a 32% en los pacientes sintomáticos, y hasta un 14% en los asintomáticos (8).

El desarrollo de resistencia al fluconazol es un proceso complejo en el cual intervienen diversos factores, tanto del huésped como del microorganismo (9-12). Entre los factores dependientes del microorganismo figuran mecanismos celulares y moleculares. Dentro de los primeros destacan: sustitución de la población sensible de C. albicans por otra especie (C. krusei, C. glabrata) o aislamiento de C. albicans más resistente; alteraciones genéticas que dan lugar al desarrollo de resistencia en el aislamiento inicial sensible de C. albicans; expresión genética transitoria que origina una cepa resistente temporal en presencia del antifúngico; y por último alteraciones en la población fúngica (microevolución). Entre los mecanismos moleculares de resistencia a los azoles hasta ahora descritos en C. albicans figuran los siguientes:

Se han descrito dos tipos de transportadores activos, el codificado por los genes cdr (superfamilia ABC, ATP Binding Cassette) y el codificado por los genes mdr1 (clase MF, Major Facilitators). La sobreexpresión de los transportadores codificados por los genes cdr confiere resistencia cruzada a diversos azoles, mientras que la sobreexpresión de los codificados por los genes mdr sólo confiere resistencia al fluconazol. La sobreexpresión de los nuevos genes cdr y cdr descritos recientemente (cdr3, cdr4, cdr5, flu1) no parece intervenir en la resistencia de C. albicans a los azoles (27).

A pesar del conocimiento de los distintos mecanismos por los cuales C. albicans es resistente al fluconazol, no se ha establecido todavía la prevalencia en clínica de dichos mecanismos de resistencia. En la Universidad de Texas en San Antonio estamos llevando a cabo un estudio longitudinal prospectivo cuyo objetivo es caracterizar la prevalencia de los mecanismos de resistencia a los azoles en un total de 64 pacientes VIH+ con candidiasis orofaríngea (32-34). Al inicio del estudio los pacientes presentaban una cifra de CD4 de 50/mm3, siendo la duración media de permanencia en el estudio de 18 meses. Se tomaron muestras (lavado bucal y torunda) en cada visita durante el episodio de candidiasis y cada tres meses (cultivo de seguimiento). Los aislamientos se identificaron por caracteres fenotípicos (color de la colonia en CHROMagar, API 20C AUX, formación de tubo germinativo) y genotípicos (técnicas de tipificación de DNA: cariotipo, RFLP con enzima de restricción Sfi1, hibridación con sonda de DNA Ca3 específica de C. albicans) (35-37). Se determinó la sensibilidad a los azoles (fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol [SCH 56592] y amfotericina B) siguiendo las normas del NCCLS (38, 39). Se estudió la sobreexpresión de transportadores activos y de la enzima diana mediante la determinación del aumento en la cantidad de RNAm correspodiente a los genes mdr1, cdr, cdr1, cdr2 y erg11, presente en los aislamientos resistentes respecto a los isogénicos sensibles. Para ello se extrajo el RNA total de los aislamientos, se transfirió a una membrana de nailon y posteriormente se hibridó con sondas marcadas radiactivamente correspondientes a los genes mdr1, cdr, cdr1, cdr2 y erg11. Se estudiaron también las mutaciones concretas en los genes erg11, para lo cual estos genes fueron amplificados mediante PCR y posteriormente secuenciados.

Un 22% de los pacientes evaluados presentaron aislamientos de C. albicans resistentes al fluconazol (CMI ­64 mg/l). En el 86% de estos casos, el desarrollo de resistencia al fluconazol tuvo lugar en una cepa persistente. El 93% de estos pacientes respondieron inicialmente al tratamiento con fluconazol, fracasando el 31% después de 112 a 1069 días de tratamiento con dosis de hasta 800 mg/día. El desarrollo de resistencia de tipo molecular se caracterizó por una combinación de mecanismos de resistencia (Tabla 1). Algunos aislamientos presentaban resistencia cruzada a otros azoles, aunque no se pudo establecer una estricta correlación entre el mecanismo de resistencia y el aumento en la CMI.

El carácter multifactorial de la resistencia de C. albicans a los fármacos antifúngicos azólicos existentes hace necesario la adopción de nuevas estrategias para combatirla, como son el desarrollo de moléculas más potentes (voriconazol, posaconazol), la investigación de nuevos antifúngicos con nuevas dianas y mecanismos de acción (pradimicinas, equinocandinas), así como combinaciones con inhibidores de los transportadores activos de membrana (10).

BIBLIOGRAFÍA

1. Dixon, D.M., Mc Neil, M.M., Cohen, M.L., Gellin, B.G., LaMontagne, J.R. Fungal infection: A growing threat. Public Health Rep 1996; 111: 226-235.
2. Maenza, J.R., Merz, W.G., Romagnoli, M.J., Keruly, J.C., Moore, R.D., Gallant, J.E. Infection due to fluconazole resistant Candida in patients with AIDS: Prevalence and microbiology. Clin Infect Dis 1997; 173: 219-225.
3. Rogers, T.E., Galgiani, J.N. Activity of fluconazole (UK 49,858) and ketoconazole against Candida albicans in vitro and in vivo. Antimicrob Agents Chemother 1986; 30: 418-422.
4. Klein, R.S., Carol, A.H., Small, C.B., Moll, B., Lesser, M., Friedland, G.H. Oral candidiasis in high-risk patients as the initial manifestation of the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med 1984; 311: 354-358.
5. Law, D., Moore, C.B., Wardle, H.M., Ganguli, L.A., Keaney, M.G.L., Denning, D.W. High prevalence of antifungal resistance in Candida spp. from patients with AIDS. J Antimicrob Chemother 1994; 34: 659-668.
6. Powderly, W.G. Resistant candidiasis. AIDS Res Hum Retroviruses 1994; 10: 925-929.
7. Bailey, E.M., Krakowsky, D.J., Rybak, M.J. The triazole antifungal agents: A review of itraconazole and fluconazole. Pharmacotherapy 1990; 10: 146-153.
8. Rex, J.H., Rinaldi, M.G., Pfaller, M.A. Resistance of Candida species to fluconazole. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 1-8.
9. White, T.C., Marr, K.A., Bowden, R.A. Clinical, cellular and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev 1998; 11: 382-402.
10. Sanglard, D., Ischer, F., Calabrese, D., de Micheli, M., Bille, J. Multiple resistance mechanisms to azole antifungals in yeast clinical isolates. Drug Resistance Updates 1998; 1: 255-265.
11. Van den Bossche, H., Marichal, P., Odds, F.C. Molecular mechanisms of drug resistance in fungi. Trends Microbiol 1994; 2: 393-400.
12. Balzi, E., Goffeau, A. Genetics and biochemistry of yeast multidrug resistance. Biochim Biophys Acta 1994; 1187: 152-162.
13. White, T.C. Increased mRNA levels of ERG16, CDR, and MDR1 correlate with increases in azole resistance in Candida albicans isolates from a patient infected with human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1482-1487.
14. Van den Bossche, H., Marichal, P., Gorrens, J., Bellens, D., Moereels, H., Janssen, P.A.J. Mutation in cytocrome P-450-dependent 14a-demethylase results in decreased affinity for azole antifungals. Biochem Soc Trans 1990; 18: 56-59.
15. Venkateswarlu, K.D., Denning, W., Manning, N.J., Kelly, S.L. Resistance to fluconazole in Candida albicans from AIDS patients correlated with reduced intracellular accumulation of drug. FEMS Microbiol Lett 1995; 131: 337-341.
16. Manavathu, E.K., Kallakuri, S., Arganoza, M.T., Pierson, C., Vázquez, J.A. Amino acid variations of cytochrome P-450-dependent lanosterol 14a-demethylase (P-450-LDM) from a fluconazole-resistant clinical isolate of Candida albicans. 36th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, New Orleans, Louisiana 1996; abstr. C68.
17. Lamb, D.C., Kelly, D.E., Schunck, W.H., Shyadehi, W.A.Z., Akhtar, M., Lowe, D.J., Baldwin, B.D., Kelly, S.L. The mutation T315A in Candida albicans sterol 14a-demethylase causes reduced enzyme activity and fluconazole-resistance through reduced affinity. J Biol Chem 1997; 272: 5682-5688.
18. L�ffler, J., Kelly, S.L., Hebart, H., Schumacher, U., Lass-Fl�rl, C., Einsele, H. Molecular analysis of cyp51 from fluconazole-resistant Candida albicans strains. FEMS Microbiol Lett 1997; 151: 263-268.
19. White, T.C. The presence of an R467K amino acid substitution and loss of allelic variation correlate with an azole resistant lanosterol 14a- demethylase in Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1488-1494.
20. Sanglard, D., Ischer, F., Koymans, L., Bille, J. Amino acid substitutions in the cytochrome P-450 lanosterol 14a-demethylase (CYP51A1) from azole-resistant Candida albicans clinical isolates contribute to resistance to azole antifungal agents. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 241-253.
21. Manavathu, E.K., Kallakuri, S., Arganoza, M.T., Vázquez, J.A. Amino acid variations of cytochrome P-450 lanosterol 14a-demethylase (CYP51A1) from fluconazole-resistant clinical isolates of Candida albicans. Rev Iberoam Micol 1999; 16: 198-203.
22. Marichal, P., Koymans, L., Willemsens, S., Bellens, D., Verhasselt, P., Luyten, W., Borges, M., Ramaekers, F.C., Odds, F.C., Van den Bossche, H. Contribution of mutations in the cytochrome P450 14-a-demethylase (Erg11, Cyp51p) to azole resistance in Candida albicans. Microbiology 1999; 145: 2701-2713.
23. Asai, K., Tsuchimori, N., Okonogi, K., Perfect, J.R., Gotoh, O., Yoshida, Y. Formation of azole-resistant Candida albicans by mutation of sterol 14-demethylase P-450. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 1163-1169.
24. Favre, B., Didmon, M., Ryder, N.S. Multiple amino acid substitutions in lanosterol 14-a-demethylase contribute to azole resistance in Candida albicans. Microbiology 1999; 145: 2715-2725.
25. Prasad, R., De, W.P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Curr Genet 1995; 27: 320-329.
26. Sanglard, D., Ischer, F., Monod, M., Bille, J. Cloning of Candida albicans genes conferring resistance to azole antifungal agents: Characterization of CDR2, a new multidrug ABC transporter gene. Microbiology 1997; 143: 405-416.
27. Sanglard, D., Kuchler, K., Ischer, F., Pagani, J.-L., Monod, M., Bille, J. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2378-2386.
28. Sanglard, D., Ischer, F., Monod, M., Bille, J. Susceptibilities of Candida albicans multidrug transporter mutants to various antifungal agents and other metabolic inhibitors. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 2300-2305.
29. Albertson, G.D., Niimi, M., Cannon, R.D., Jenkinson, H.F. Multiple efflux mechanisms are involved in Candida albicans fluconazole resistance. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 2835-2841.
30. Franz, R., Kelly, S.L., Lamb, D.C., Kelly, D.E., Ruhnke, M., Morschh�user, J. Multiple molecular mechanisms contribute to a stepwise development of fluconazole resistance in clinical Candida albicans strains. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 3065-3072.
31. López-Ribot, J.L., McAtee, R.L., Perea, S., Kirkpatrick, W.R., Rinaldi, M.G., Patterson, T.F. Multiple resistant phenotypes of Candida albicans coexist during episodes of oropharyngeal candidiasis in human immunodeficiency virus-infected patients. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 1621-1630.
32. Revankar, S.G., Kirkpatrick, W.R., McAtee, R.K., Dib, O.P., Fothergill, A.W., Redding, S.W., McGough, D.A., Rinaldi, M.G., Patterson, T.F. Detection and significance of fluconazole resistance in oropharyngeal candidiasis in HIV-infected patients. J Infect Dis 1996; 174: 821-827.
33. Perea, S., López-Ribot, J.L., Cantu, R.A., Kirkpatrick, W.R., McAtee, R.K., Patterson, T.F. Prevalence of resistance mechanisms to azoles in C. albicans isolates from HIV infected patients with oropharyngeal candidiasis. 39th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, San Francisco, California 1999; abstr. 296.
34. Kirkpatrick, W.R., López-Ribot, J.L., Perea, S., McAtee, R.K., Patterson, T.F. Natural history and evolution of the development of fluconazole resistance in Candida albicans isolates colonizing and/or infecting the oral cavity of HIV-infected patients. 39th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, San Francisco, California 1999; abstr. 1905.
35. Patterson, T.F., Revankar, S.G., Kirkpatrick, W.R., Dib, O., Fothergill, A.W., Redding, S.W., Sutton, D.A., Rinaldi, M.G. Simple method for detecting fluconazole resistant yeasts with chromogenic agar. J Clin Microbiol 1996; 34: 1794-1797.
36. Patterson, T.F., Kirkpatrick, W.R., Revankar, S.G., McAtee, R.K., Fothergill, A.W., McCarthy, D.I., Rinaldi, M.G. Comparative evaluation of macrodilution and chromogenic agar screening for determining fluconazole susceptibility of Candida albicans. J Clin Microbiol 1996; 34: 3237-3239.
37. Schmid, J., Voss, E., Soll, D.R. Computer assisted methods for assessing strain relatedness in Candida albicans by fingerprinting with the moderately repetitive sequence Ca3. J Clin Microbiol 1990; 28: 1236-1243.
38. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast's: Approved standard. NCCLS Document M27-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA 1997.
39. Rex, J.H., Pfaller, M.A., Galgiani, J.N., Bartlett, M.S., Espinel-Ingroff, A., Ghannoum, M.A., Lancaster, M., Odds, F.C., Rinaldi, M.G., Walsh, T.J., Berry, A.L. Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibility testing: Conceptual framework and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, itraconazole, and Candida infections. Clin Infect Dis 1997; 24: 235-247.