Resistencia a las asociaciones debetalactámicos e inhibidores de betalactamasas

J.I. Alós y J. Oteo Servicio de Microbiología, Hospital de Móstoles, 28935 Móstoles, Madrid.

En muchas especies de gramnegativos de importancia clínica y en Staphylococcus aureus el mecanismo más frecuente de resistencia a antibióticos betalactámicos es la producción de enzimas denominadas betalactamasas. Para restablecer la actividad de los betalactámicos se introdujeron en la práctica clínica compuestos que inhibían algunas betalactamasas (TEM, SHV, OXY y otras). Desde mediados de los años 1980 se han usado el ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam, en combinación con la amoxicilina y la ticarcilina, la ampicilina y la piperacilina, respectivamente, restableciendo la actividad de estos últimos frente a patógenos tan importantes para los humanos como S. aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, al poco o incluso antes de la introducción en clínica de las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas se encontraron cepas de E. coli resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico (1, 2). En E. coli existen varios mecanismos de resistencia a estas asociaciones. Uno de ellos es la producción de cantidades elevadas de la betalactamasa TEM-1 (1, 3-6), la más común en esta especie (6, 7), generalmente debido a pequeños plásmidos multicopia (8) o a mutaciones en el promotor (9). Cepas hiperproductoras de TEM-1 y resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico se habían aislado antes de introducirse en clínica las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas (2, 4). Otro mecanismo de resistencia lo constituyen las alteraciones de la permeabilidad por pérdida de porinas junto con una producción "normal" de TEM-1 (10), y otra posibilidad es la hiperproducción de su betalactamasa cromosómica, al no ser ésta sensible a los inhibidores de betalactamasas (11). También se ha descrito la producción de betalactamasas plasmídicas del tipo OXA-1, mucho menos sensible a la inhibición que las del tipo TEM o SHV (12, 13). Por último, en años recientes han surgido betalactamasas con afinidad disminuida por los inhibidores de betalactamasas (betalactamasas resistentes a inhibidores). Los primeros ejemplos de estas betalactamasas se observaron en mutantes conseguidos en el laboratorio con oligonucleótidos degenerados (14) o por mutagénesis (15). Las enzimas obtenidas en el primer caso presentaban sustituciones de la metionina de la posición 69 (esquema de numeración de Ambler) (16) por aminoácidos alifáticos hidrófobos tales como la leucina, la valina o la isoleucina. Poco después se aislaron de muestras clínicas las primeras cepas con betalactamasas resistentes a inhibidores (17-19). En E. coli han surgido como resultado de mutaciones únicas o múltiples en los genes estructurales de las betalactamasas TEM-1 y TEM-2, y más raramente de la SHV-5. Sustituciones de aminoácidos en las posiciones 69, 130, 244, 275 y 276, solas o en combinación con otras, se consideran la causa de la resistencia a los inhibidores de betalactamasas (12, 13, 20-29) (Tabla 1).

Tabla 1. Mutaciones encontradas en las betalactamasas resistentes a inhibidores que se han descrito. Las betalacmalasas de que derivan se destacan en negrita.
  Posici$oacute;n amino$aacute;cido.
Betalactamasas 69 130 165 182 244 261 275 276
TEM-1 Met Ser Trp Met Arg Val Arg Asn
TEM-31 = IRT-1         Cys      
TEM-30 = IRT-2         Ser      
TEM-33 = IRT-5 Leu              
TEM-34 = IRT-6 Val              
TEM-32 = IRT-3 Ile     Thr        
TEM-35 = IRT-4 Leu             Asp
TEM-36 = IRT-7 Val             Asp
TEM-37 = IRT-8 Ile             Asp
TEM-38 = IRT-9 Val           Leu  
TEM-39 = IRT-10 Leu   Arg         Asp
TEM-40 = IRT-11 Ile              
TEM-45 = IRT-14 Leu           Gnl;  
TEM-51 = IRT-15         His      
TEM-58         Ser Ile    
TEM-60   Gly            
 
TEM-2         Arg      
TEM-44 = IRT-13         Ser      
 
SHV-5   Ser            
SHV-10   Gly            
 
OXY-2   Ser            
IRKO-1   Gly            

La detección fenotípica de cepas productoras de betalactamasas resistentes a los inhibidores se puede realizar estudiando el patrón de resistencia a las penicilinas, a las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas y a las cefalosporinas. Una bacteria resistente a la ampicilina y la ticarcilina, resistente o con resistencia intermedia a las asociaciones de estos antibióticos con ácido clavulánico, pero sensible a la cefalotina, debe orientarnos hacia la producción de betalactamasas resistentes a los inhibidores. Sin embargo, en algunos trabajos realizados con cepas de E. coli resistentes o con resistencia intermedia a amoxicilina-ácido clavulánico, sólo se detectaron aislamientos productores de betalactamasas resistentes a los inhibidores entre los claramente resistentes a esta asociación antibiótica (12, 30). El mencionado perfil de resistencia no permite la discriminación entre las betalactamasas resistentes a los inhibidores y las betalactamasas de tipo OXA. La medición de los halos de inhibición obtenidos con cefalosporinas como la ceftazidima y la cefepima puede ayudarnos a diferenciar entre cepas productoras de uno u otro tipo de enzima (31).

En E. coli resistente a la ampicilina la CMI (en mg/l) para amoxicilina-ácido clavulánico suele agruparse en los valores 8/4, 16/8 y 32/16, que se categorizan como sensible, intermedio y resistente, respectivamente. La variabilidad inherente al método puede ser una de las causas de que se observen distintas cifras de resistencia entre países e incluso en el mismo país, aunque otra causa puede ser la diferencia temporal en la realización de los trabajos (12, 30, 32-34).

En un estudio realizado en Londres con cepas aisladas entre 1990 y 1994 se encontró que aproximadamente el 5% (del 10% al 15% de las resistentes a la ampicilina) eran resistentes o con resistencia intermedia a amoxicilina-ácido clavulánico, y que había habido pocos cambios en esos cinco años (12). El principal mecanismo, observado en el 61% de las cepas, era la hiperproducción de TEM-1, seguido de la producción de OXA-1 (15%) y de la hiperproducción de betalactamasas cromosómicas (13%), siendo raras las betalactamasas resistentes a inhibidores (12). Hay que tener en cuenta que la mayoría de las cepas estudiadas presentaban una CMI de amoxicilina-ácido clavulánico de 16/8 mg/l (resistencia intermedia) y sólo 21 tenían CMI >32/16 mg/l. En este último grupo es donde se encontraron tres cepas con betalactamasas resistentes a los inhibidores derivadas de TEM (Inhibitor Resistant-TEM o IRT) (12).

En Francia, en 1993, casi un 25% de los E. coli aislados de orina en un hospital y un 10% de los de la comunidad eran resistentes a la amoxicilina-ácido clavulánico. La cuarta parte de los aislamientos hospitalarios y casi la mitad de los de la comunidad presentaban un patrón de antibiograma sugestivo de la presencia de IRT, que se confirmó con estudios moleculares (30). Por tanto, casi el 5% de los aislamientos de E. coli producían IRT, siendo rara la resistencia por producción de OXA-1 (30). Hay que resaltar que sólo encontraron IRT en las cepas resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico, pero no en las que mostraban resistencia intermedia, y que había significativamente más en las de la comunidad que en las del hospital (45% versus 27% de las resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico, respectivamente) (30). Posteriores estudios sobre éstas y otras cepas demuestran la diversidad de clones, definidos por ribotipificación, y de genes que codifican las IRT causales (21, 35). Sobre 107 cepas con IRT, entre las que se detectaron hasta nueve tipos diferentes de enzimas, el 50% diferían de TEM-1 sólo en un aminoácido y el otro 50% en dos o tres aminoácidos, siendo las más frecuentes TEM-30 = IRT-2 (20,6%), TEM-37 = IRT-8 (18,7%) y TEM-33 = IRT-3 (15,9%) (21). Sin embargo, en otro estudio coetáneo realizado también en Francia, Zhou y cols. (13) encuentran que la mitad de sus cepas de E. coli resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico y sensibles a la cefalotina produce OXA-1 y la otra mitad seis tipos distintos de IRT.

Recientemente se ha caracterizado una nueva betalactamasa derivada de TEM-1 en una cepa de origen clínico de E. coli con resistencia a las cefalosporinas de tercera generación y a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas. Las mutaciones que presentaba eran las mismas que muestra TEM-35, también denominada IRT-4 (Leu-69 y Asp-276), y las que presenta la betalactamasa de espectro ampliado TEM-15 (Lys-104 y Ser-238) (36). Sin embargo, la enzima resultante, TEM-50, tenía menos actividad catalítica sobre las cefalosporinas de tercera generación que TEM-15 y perdía casi toda la capacidad de resistir a los inhibidores de TEM-35 = IRT-4 (36).

En una cepa cepa clínica de E. coli se ha encontrado una betalactamasa resistente a inhibidores derivada de SHV-5, conocida como SHV-10 (29), por lo que en esta especie dichas betalactamasas no sólo derivan de TEM.

En otras especies de bacilos gramnegativos importantes en clínica también se han encontrado betalactamasas resistentes a inhibidores. En 1995, Lemozy y cols. (37) describen por primera vez la presencia de betalactamasas derivadas de TEM-1 en K. pneumoniae, TEM-31 = IRT-1 en una cepa y TEM-30 = IRT-2 en otra. Curiosamente, estas enzimas (TEM-30 y TEM-31) también habían sido las primeras IRT descritas en E. coli. En 1997 Bermudes y cols. (38) encuentran TEM-30 = IRT-2 en otra cepa de la misma especie. Hay que destacar que no se han descrito todavía betalactamasas resistentes a inhibidores derivadas de SHV-1 en cepas clínicas de K. pneumoniae, a pesar de que esta enzima es la más frecuente en dicha especie. Sin embargo, sí se han conseguido derivadas de SHV-1 por mutagénesis en E. coli (39, 40).

En 1996 Bret y cols. (22) informan de la presencia de una IRT derivada de TEM-2, con un cambio Arg244Ser, en diez cepas de P. mirabilis. En esta especie la betalactamasa más frecuente es TEM-2, al contrario de lo que sucede en E. coli, por lo que no sorprende que sea una mutación en el gen blaTEM-2 la que origine esta nueva betalactamasa IRT. El mismo cambio ya se había descrito en TEM-1 dando lugar a TEM-30 = IRT-2. Las diez cepas pertenecían a seis ribotipos distintos, por lo que no puede considerarse un clon único extendido sino más bien clones de distinto origen seleccionados bajo presión antibiótica (22).

Recientemente se han encontrado dos cepas de Klebsiella oxytoca resistentes a los inhibidores de betalactamasas. Ambas se caracterizan por una mutación que produce el cambio Ser130Gly, pero mientras que en la descrita por Sirot y cols. (28) la sustitución se observa en la betalactamasa cromosómica OXY-2 característica de esta especie, la que describen Bermudes y cols., denominada TEM-60, deriva de TEM-2 (27). Esta misma mutación se encuentra también en la betalactamasa resistente a inhibidores conocida como SHV-10, derivada de SHV-5, detectada en una cepa de E. coli (29).

La presencia de betalactamasas resistentes a inhibidores también se ha descrito en Citrobacter freundii. En 1993, Hunter y cols. (41) aislaron de ganado vacuno una cepa de C. freundii productora de IRT.

Se ha detectado resistencia transferible a la asociación de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas en cepas de Shigella flexneri debido a la hiperproducción de TEM-1 por una mutación en el promotor (42). En España, Miró y cols. (43) también han comunicado esta resistencia en S. flexneri sin especificar el mecanismo.

En Salmonella también se han encontrado cepas resistentes a la asociación de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas (43-45), por hiperproducción de TEM-1 (44) o por una probable gran producción de la betalactamasa PSE-1 (45).

Por otra parte, en un estudio multicéntrico reciente realizado en EE.UU. se han encontrado varias cepas de H. influenzae productoras de betalactamasas y resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico, el 1,1% del total y el 3% de las productoras de betalactamasas (46). Aunque el mecanismo exacto no se conoce, hay que tener en cuenta que TEM-1 es la betalactamasa más frecuente en esta especie, por lo que no sería de extrañar que la presencia de IRT, sola o asociada a cambios en las PBP o en la permeabilidad, explicase el mecanismo de resistencia.

Los cambios de aminoácidos más frecuentemente descritos que confieren resistencia clínicamente significativa a los inhibidores de betalactamasas se han estudiado sobre todo en TEM y se producen en las posiciones 69, 130, 244, 275 y 276 (47). Estas variaciones, solas o asociadas a otras, están presentes en todas las IRT descritas hasta la fecha. Sin embargo, las mutaciones son puntuales y en ningún caso se han descrito más de tres por betalactamasa. Met69 es el aminoácido que cambia con más frecuencia (IRT-3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 14), siendo sustituido por leucina, isoleucina o valina. A pesar de la proximidad al centro activo (Ser70), su importancia se debe más a que su cadena lateral forma parte del lugar de unión de la enzima al sustrato formado por las amidas de Ser70 y Ala237 (48).

La sustitución de Arg244 por aminoácidos con cadenas laterales más cortas, como cisteína (IRT-1), serina (IRT-2, IRT-13) e histidina (IRT-15), modifica la interacción de enzima y sustrato, disminuyendo su afinidad. Además, estos aminoácidos con cadenas más cortas serían incapaces de activar la molécula de agua implicada en el proceso de inactivación de la betalactamasa por el ácido clavulánico (49). El Asn276 puede verse sustituido por Asp (IRT-4, 7, 8 y 10) o por Leu (IRT-9) y la Arg275 por Glu (IRT-14). La proximidad de ambas a Arg244, en la configuración de la estructura terciaria, genera interacciones electrostáticas que producen un posible desplazamiento de la molécula de agua implicada en el proceso por el cual el ácido clavulánico inactiva a la betalactamasa (50).

Sin embargo, algunas mutaciones estudiadas no parecen originar cambios funcionales. Probablemente se trate de sustituciones que ayuden a corregir defectos de estabilidad de la proteína creados por otras mutaciones, o a reponer la actividad enzimática perdida por una mutación previa (51, 52). Un ejemplo de estas mutaciones compensatorias lo tenemos en el cambio Met182Thr de IRT-3, que ayuda a estabilizar el centro activo de la enzima con la sustitución previa de Met69Ile (53).

El residuo Ser130 se considera muy importante en el proceso catalítico de las betalactamasas de la clase A, ya que participa en la geometría del centro activo. Por esta razón se trata de un aminoácido muy conservado en este tipo de enzimas. No obstante, la sustitución Ser130Gly se ha descrito en tres betalactamasas resistentes a inhibidores, derivadas de OXY-2 (12) y TEM-2 (27) en K. oxytoca y de SHV-5 en E. coli (29).

Las mutaciones en el promotor de los genes blaIRT parecen afectar al grado de resistencia que la enzima codificada muestra a los inhibidores (23, 54). Así, Caniša y cols. (55) demuestran que una IRT puede expresar distintos grados de resistencia al ácido clavulánico en función de variaciones puntuales en el promotor.

En general, las sustituciones de aminoácidos reseñadas alteran la especificidad de la enzima por el sustrato, disminuyendo en todos los casos la afinidad de la enzima por los inhibidores de betalactamasas. La disminución será mayor o menor dependiendo del tipo de enzima y del sustrato, en este caso del inhibidor (ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam). La modificación producida en su perfil de actuación se manifiesta como una incapacidad de los inhibidores de betalactamasas de inactivar a la enzima, a la vez que ésta conserva su capacidad de hidrolizar antibióticos betalactámicos (56, 57), aunque en algunos casos esta capacidad se ve disminuida o aumentada dependiendo del antibiótico y de la enzima.

La existencia de mutaciones espontáneas es un factor clave para explicar la gran adaptabilidad genética de las poblaciones bacterianas. Las betalactamasas son muy tolerantes a los cambios de aminoácidos de su estructura. Estudios realizados en el gen que codifica para TEM-1 demuestran que en 43 posiciones el aminoácido no se puede cambiar sin que la enzima pierda su actividad catalítica; sin embargo, en las 220 posiciones restantes tolera sustituciones sin perderla (51, 52). Esta gran tolerabilidad permite un número muy alto de combinaciones de aminoácidos sin que la enzima pierda su función, algunas de las cuales alteran sus propiedades y como consecuencia los sustratos sobre los que actúa (51).

Las bacterias con enzimas TEM-1, TEM-2 y del tipo SHV han sido sometidas a una fuerte presión selectiva tras la introducción en clínica de las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas. Como consecuencia de ello se ha producido, en ciertos casos, una selección de las mutaciones de los genes estructurales de estas betalactamasas que les conferían resistencia a los inhibidores. En concreto, los genes de las IRT provienen de una evolución convergente, ya que se han originado a partir de mutaciones en diferentes genes (TEM-1A, TEM-1B y TEM-2) (23).

La presencia de los genes que codifican betalactamasas resistentes a inhibidores en plásmidos o transposones, elementos genéticos fácilmente transferibles, hace que el peligro de intercambio entre cepas de la misma especie, e incluso de distinta especie, sea un hecho a tener en cuenta en el futuro. Por otra parte, existe la posibilidad de la aparición de nuevas betalactamasas resistentes a inhibidores derivadas de otras betalactamasas. Bonono y cols. (58) consiguieron un mutante de laboratorio en el cual el cambio Met69Leu en la betalactamasa OHIO-1 confería resistencia a los inhibidores de betalactamasas.

La introducción en la práctica médica de las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas ha sido probablemente la causa de la aparición en clínica de cepas productoras de betalactamasas resistentes a los inhibidores. El uso de estas asociaciones es más frecuente en atención primaria que en los hospitales, lo cual explicaría la mayor prevalencia de cepas portadoras de IRT entre los aislamientos de la comunidad que entre los hospitalarios (30). El peligro de la aparición de nuevas mutantes con este fenotipo de resistencia, o el de la diseminación de las ya existentes, es un hecho probable que debe ser considerado y a ser posible evitado con una mejora en el uso de estas asociaciones antibióticas.

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