INTRODUCCIÓN

La aparición y diseminación de bacterias resistentes a los antibióticos convencionales es un problema importante en la práctica clínica, especialmente en los pacientes inmunodeprimidos. Para afrontar estos problemas se están investigando nuevas clases de antimicrobianos que puedan ser utilizados en infecciones por microorganismos resistentes.

En las últimas décadas se han descrito diversos péptidos con actividad antimicrobiana. Algunos pueden ser elaborados por determinadas bacterias y se sintetizan en complejos multienzimáticos. Dentro de este grupo se encuentran las polimixinas, los glucopéptidos y la bacitracina. Los péptidos descritos más recientemente son sintetizados como péptidos naturales en los ribosomas y los pueden producir todas las formas de vida (incluyendo las bacterias) como moléculas de defensa. Existe una gran variedad de genes que codifican péptidos antimicrobianos producidos por una multitud de organismos vivos como parte de sus mecanismos de defensa naturales.

En 1962 Kiss y Michl (1) observaron la presencia de un péptido con actividad antimicrobiana y hemolítica en las secreciones de la piel del sapo de panza amarilla, Bombina variegata, y se le denominó bombinina. En 1972 se describió la melitina en el veneno de las abejas (2). Posteriormente, el grupo del Dr. Hans G. Boman en el Karolinska Institut de Estocolmo demostró la presencia de péptidos antibióticos inducibles en la hemolinfa de lepidópteros (3). Desde entonces se han encontrado numerosos péptidos en diferentes especies y se sabe que tanto plantas como animales comparten un mecanismo de defensa efectivo frente a los patógenos invasores. Se han descrito en insectos (3), crustáceos (4), anfibios (5), mamíferos (6) y plantas (7), además de bacterias, hongos y virus (7, 8). En determinadas circunstancias, ante un proceso inflamatorio o infeccioso, aumenta la presencia de péptidos antibióticos en diferentes animales y también en los humanos.

Los péptidos producidos por células eucarióticas pueden presentar actividad antibacteriana, antifúngica, antiparasitaria, antiviral o antitumoral (7-12).

ESTRUCTURA QUÍMICA

La mayoría de los péptidos antibióticos descritos comparten cierto carácter catiónico que favorece su interacción con las membranas celulares, pero difieren en cuanto a la secuencia, estructura secundaria o terciaria, estructura genética y la localización y función dentro del organismo (9).

Un importante grupo de péptidos lo constituyen moléculas lineales, carentes de puentes disulfuro. Entre éstos, algunos son propensos a formar una hélice a; han sido los más estudiados y los que están más definidos estructuralmente. Tienen en común su homología en la estructura primaria, así como la presencia de un residuo de triptófano en la zona N-terminal o de ciertos residuos básicos conservados.

Existen otras moléculas peptídicas lineales que no forman hélice a, pero que tienen en común la presencia de aminoácidos poco frecuentes, como arginina, prolina y triptófano, en mayor cantidad de lo habitual.

El resto de los péptidos estudiados son antibióticos de estructura cíclica, que contienen cisteína y forman uno o varios puentes disulfuro intramoleculares. Dentro del grupo de los péptidos con estructura cíclica con dos o más puentes disulfuro cabe destacar las diversas familias de defensinas que están presentes en los gránulos de las células fagocíticas.

En la Tabla 1 se muestra una clasificación de los péptidos de acuerdo con su estructura química y su origen.

CLASIFICACIÓN SEGÚN EL ORIGEN

Los péptidos estudiados hasta el momento se pueden agrupar en péptidos naturales, obtenidos directamente de un organismo, y sintéticos, que pueden ser similares a los naturales pero producidos químicamente y con posibles modificaciones.

Péptidos derivados de insectos

Los péptidos de los insectos pueden ser liberados en el interior del animal, dentro de la hemolinfa, como la cecropina, o bien ser excretados como veneno, por ejemplo la melitina (8). Actualmente existen numerosos péptidos total o parcialmente secuenciados (además de sus isoformas), que son derivados de insectos y que actúan como defensinas.

Las cecropinas son una familia de péptidos que se aislaron por primera vez de la hemolinfa de la mariposa de la seda Hyalophora cecropia (3); están cargados positivamente y forman hélices a en solución. Las principales cecropinas derivadas de insectos (cecropinas A, B y D) tienen de 35 a 37 residuos. También se ha descrito un péptido similar a las cecropinas de 31 residuos, aislado del intestino delgado del cerdo y que se conoce como cecropina P (13), lo cual sugiere que, aunque se encuentren en insectos, pueden estar ampliamente distribuidos en todo el reino animal (14).

Péptidos derivados de anfibios

Los péptidos con actividad antibiótica son muy abundantes en las secreciones de la piel y en el sistema digestivo de los sapos (15). Los péptidos encontrados en anfibios son muy diversos y se pueden hallar variaciones incluso dentro de la misma especie. Las magaininas son una clase de péptidos naturales catiónicos con un amplio espectro de actividad antimicrobiana.

Péptidos producidos por mamíferos

Los péptidos producidos por los mamíferos pueden estar presentes dentro de los gránulos de los neutrófilos, en las secreciones de las células epiteliales de la piel o mucosas o como productos de degradación de proteínas (16). En los neutrófilos se encuentran gran cantidad de proteínas y péptidos con actividad antimicrobiana, como lisozima, lactoferrina, bactenecinas, defensinas, indolicidinas, etc. (17). Los péptidos de mamíferos más estudiados son las defensinas, que se pueden clasificar en defensinas a (o clásicas) y b. Las defensinas a son las clásicas, caracterizadas en neutrófilos y células de Paneth, y las defensinas b están producidas por las células epiteliales de la piel y las mucosas, y también por los neutrófilos y los leucocitos (8).

Se ha observado que algunos genes que codifican péptidos se inducen de forma significativa en presencia de infecciones, por ejemplo en la mucosa respiratoria. La superficie de la mucosa respiratoria está expuesta continuamente a las bacterias que se encuentran en el aire que respiramos, y para prevenir las infecciones se utilizan diferentes mecanismos de defensa, como la liberación de determinados péptidos con actividad antimicrobiana. Uno de los genes inducibles es el que codifica para el TAP (Tracheal Antimicrobial Peptide), una defensina que se expresa en las células del epitelio ciliado respiratorio (18). Sin embargo, existen diversos factores que pueden influir sobre la acción de los péptidos, como la concentración a que se encuentran (parámetro extremadamente complejo de obtener), la concentración fisiológica de sal, la sinergia con otros antibióticos, etc. (18).

Se han identificado diferentes péptidos antibióticos mieloides de diversas especies de mamíferos y que derivan de un precursor llamado catelicidina (19). Los péptidos de esta familia varían en secuencia, estructura y longitud y pueden ser hélices a (SMAP-29, BMAP-27, BMAP-28), ricos en cisteína (protegrina), ricos en prolina y arginina (fragmentos N-terminal de Bac7) y ricos en triptófano (indolicidina) (20, 21). La indolicidina es un péptido de 13 aminoácidos que está presente en los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos bovinos (20). Recientemente se ha descrito el LL-37, con estructura de hélice a, que se encuentra en los neutrófilos humanos junto con las defensinas b y que es un precursor de la hCAP-18 (CAP = Cationic Antimicrobial Peptides) (21). Aunque se han descrito diversos precursores de la familia de las catelicidinas en terneras y cerdos, hCAP-18 es la única de humanos (22). La protegrina 1 (PG-1) es un péptido antimicrobiano de amplio espectro que contiene 18 aminoácidos, tiene dos puentes disulfuro intramoleculares y se aisló originariamente de leucocitos porcinos (23).

Tabla 1. Clasificación de los principales péptidos antibióticos de origen eucariótico según su estructura química (9).

Péptidos derivados de plantas

Los péptidos derivados de mamíferos y bacterias presentan una importante actividad antibacteriana; sin embargo, las defensinas de las plantas presentan actividad principalmente antifúngica, reflejando la importancia de las infecciones por hongos en el mundo vegetal (7, 8, 24).

Péptidos sintéticos

A partir de la estructura de los péptidos naturales se están llevando a cabo variaciones en la síntesis de nuevos péptidos que mejoren la actividad antimicrobiana y presenten baja toxicidad (25, 26). También se está aplicando la química combinatoria para sintentizar al azar péptidos con posible actividad antibacteriana (27). MSI-78 es un análogo de magainina, de 22 aminoácidos, que está siendo desarrollado como antimicrobiano tópico (28).

ESPECTRO DE ACTIVIDAD

Se ha descrito actividad antibacteriana de diferentes péptidos antibióticos de origen eucariótico frente a organismos grampositivos y gramnegativos (13, 28-34). Sin embargo, en muchas ocasiones se han estudiado más en patógenos de insectos y plantas que en patógenos humanos, y además los trabajos publicados son difíciles de valorar, ya que utilizan técnicas que no son comparables con los métodos estándar de determinación de la CMI.

Algunos autores han observado que al determinar la actividad de los péptidos siguiendo las normas del NCCLS con agar Mueller, la actividad es menor que utilizando otros métodos tales como el ensayo de difusión radial (21). Muchos de los péptidos antimicrobianos son policatiónicos y por lo tanto pueden ser incompatibles con el caldo de Mueller- Hinton (MHB) convencional, formando complejos o incluso precipitando. Este problema podría resolverse purificando el MHB por una columna de intercambio aniónico antes de usarlo (21). Además, la acción de algunos péptidos sobre determinadas especies bacterianas puede verse afectada por la concentración de NaCl en el medio y por la adición de cationes divalentes como el Ca2+ (21).

En general, las bacterias gramnegativas son más sensibles a la acción de los péptidos que los microorganismos grampositivos, aunque dentro de los gramnegativos la sensibilidad puede ser variable, dependiendo de la composición en lipopolisacáridos de la membrana externa. Se ha observado que la acción de las magaininas puede verse disminuida por diversos factores, como la carga y la concentración de lipopolisacáridos, y la presencia o ausencia de antígeno O (35).

Las protegrinas son muy activas frente a Neisseria gonorrhoeae (36), además de inactivar los cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis (37) y los viriones del VIH tipo 1 (38), por lo que podrían considerarse como un posible agente tópico para prevenir las enfermedades de transmisión sexual.

Algunos péptidos pueden no tener actividad sobre las bacterias, pero presentan efecto sinérgico significativo cuando se asocian con antibióticos hidrofóbicos y anfipáticos (39). Cuando se añaden concentraciones subinhibitorias de cecropina B a diferentes antibióticos se observa un aumento de la actividad de los fármacos. Así, la clindamicina, la eritromicina, el ácido fusídico, la novobiocina y la rifampicina, que no son activos frente a Escherichia coli ni Pseudomonas aeruginosa, son activos cuando se les añade cecropina B, probablemente porque aumenta la permeabilidad de la membrana externa (14).

Un aspecto interesante es la actividad que muestran in vitro algunos de los péptidos de origen eucariótico sobre bacterias multirresistentes, para las que existen pocas posibilidades terapéuticas, como es el caso de Acinetobacter baumannii (30) o de patógenos resistentes implicados en fibrosis quística (31). En relación a este último caso, se han diseñado péptidos insensibles al alto contenido en sal que puede encontrarse en las secreciones pulmonares de estos pacientes, que presentan buena actividad in vitro frente a los patógenos habituales en la fibrosis quística, parecen no ser tóxicos en los ensayos realizados y podrían ser utilizados en forma de aerosol para tratar las infecciones asociadas a esta enfermedad (31).

En las Tablas 2 a 4 se ofrecen datos de actividad in vitro sobre diferentes patógenos humanos de algunos péptidos de origen eucariótico.

MECANISMO DE ACCIÓN

El principal mecanismo de acción de la mayoría de los péptidos antibióticos consiste en el aumento de la permeabilidad de la membrana (8, 26). En general, los péptidos tienen en común la hidrofobicidad y las cargas positivas que les permiten presentar un mecanismo de acción similar. Este mecanismo de acción se puede producir en dos etapas: en primer lugar, la unión del péptido a la bicapa lipídica mediante una interacción electrostática, y posteriormente la formación del poro (40). En algunos casos se produce una translocación del péptido, que se encuentra en la capa externa de la bicapa lipídica, a la capa interna de la bicapa, con lo que consigue penetrar dentro de la bacteria. Una vez atravesada la membrana externa puede actuar sobre la membrana citoplásmica, que es la diana principal. La interacción con los lípidos para permeabilizar las membranas puede producirse por varios mecanismos: a) formación de poros a través del modelo "barrel-stave"; b) un proceso de captación autopromovido; c) destrucción de la membrana con el modelo de "alfombra" (carpet-like o detergent-like); y d) modelo toroidal.

Existen algunos ejemplos de péptidos aniónicos y parecen ser menos activos que los catiónicos y con diferente mecanismo de acción (10). Otros péptidos ricos en histidina tienen una carga neta dependiente del pH (10).

Cuando se estudia el mecanismo de acción de la indolicidina se observa que se une a la superficie del lipopolisacárido con alta afinidad, resultando en un paso a través de la membrana externa autopromovido y una posterior formación de canales en la membrana citoplásmica que lleva a la muerte celular (41). La esterificación de la indolicidina en el terminal C aumenta la actividad antimicrobiana debido, en parte, a un aumento en la unión al lipopolisacárido y al aumento de la permeabilización de la membrana externa (20).

La actividad antimicrobiana depende también de características de la membrana, como composición de fosfolípidos, contenido en esterol, potencial de membrana o presencia de polianiones. El potencial de membrana del organismo contribuye a la resolución final de la interacción de péptido y patógeno.

Tabla 4. Actividad in vitro de MSI-78, pexiganan, un análogo de magainina, sobre bacterias anaerobias (34).

Además de la permeabilización de la membrana, existen evidencias suficientes que indican que los péptidos antimicrobianos ejercen su actividad mediante otros mecanismos (10). Se ha detectado la inhibición de la síntesis de proteínas de membrana específicas y de proteínas del estrés, rotura de la cadena de DNA, interacciones con el DNA o producción de peróxido de hidrógeno por diferentes péptidos (10). Los péptidos antimicrobianos pueden actuar también por un mecanismo de autodestrucción, como la apoptosis en las células eucarióticas o la autólisis en las células bacterianas. Por último, algunos péptidos pueden actuar como inhibidores de los factores de patogenicidad producidos por determinadas bacterias (10).

MECANISMOS DE RESISTENCIA

Se han descrito determinadas especies bacterianas que son resistentes a prácticamente todos los péptidos antibióticos de origen eucariótico, como Proteus spp., Serratia spp. y Burkholderia spp. Cuando se intenta desarrollar in vitro resistencia en un microorganismo de una especie generalmente sensible, ésta se obtiene con muy poca frecuencia.

En general, la resistencia no es cruzada con los antibióticos conocidos, ya que los mecanismos de acción son independientes. El único que presenta un mecanismo de acción similar es la polimixina B y la resistencia puede ser cruzada. De manera similar a lo que ocurre con los antibióticos conocidos, se pueden encontrar diferentes mecanismos de resistencia:

1) Inactivación del péptido: el alto contenido en residuos básicos de los péptidos favorece la degradación por proteasas. En algunas bacterias se han descrito enzimas capaces de degradar los péptidos de forma específica, como en cepas de Bacillus spp. y de P. aeruginosa, que degradan cecropinas, o de Salmonella spp. que degradan magaininas (10). La inactivación de péptidos con puentes disulfuro puede producirse por la acción de reductasas que se encuentran en la membrana.

2) Incapacidad de llegar a la diana bacteriana: antes de llegar a su diana, la membrana citoplásmica, deben atravesar la membrana externa y la capa de peptidoglicano. La heparina, un componente de la matriz extracelular, puede inhibir a determinados péptidos. Como hemos visto anteriormente, la unión de los péptidos catiónicos se produce por interacción electrostática con los lipopolisacáridos cargados negativamente. Si existe una modificación o desaparición del lipopolisacárido puede aparecer resistencia. Las cepas de Proteus spp. y Burkholderia spp. presentan un lipopolisacárido con menor carga negativa y por esta razón son resistentes de forma natural (10). La ausencia de lipopolisacárido se ha descrito como mecanismo de resistencia a la bactenecina en Burkholderia burgdorferi. Además, también se han implicado proteínas de la membrana externa como posible mecanismo de resistencia.

3) Modificación de la diana: se han descrito diferentes elementos de la membrana plasmástica como posibles mecanismos de resistencia. La composición de los lípidos, con menos fosfolípidos aniónicos, se asocia con resistencia natural en Serratia spp. El potencial de membrana está asociado con una mayor permeabilización por los péptidos en bacterias o en modelos de membrana, y una variación en este potencial puede dar lugar a resistencia (10).

4) Mecanismos de captación-expulsión: se han descrito sistemas de transporte a través de la membrana de patógenos de plantas y de animales, que captan el péptido al interior de la célula para ser degradado. También pueden existir sistemas de expulsión similares a los implicados en caso de multirresistencia. Este último mecanismo se ha descrito en N. gonorrhoeae(10).

APLICACIONES CLÍNICAS

Se están estudiando aplicaciones terapéuticas de los péptidos para infecciones bacterianas, virales, fúngicas o parasitarias. También tienen un futuro prometedor en cuanto a su posible función antitumoral. En la Tabla 5 se puede observar la fase clínica en que se encuentran algunos de los péptidos con actividad antimicrobiana (12).

Actualmente, las aplicaciones clínicas van dirigidas a los siguientes campos: tratamientos tópicos, infecciones oculares, infecciones bucodentales, tratamientos en aerosol y tratamiento oral para infecciones gastrointestinales. Para el uso parenteral deben resolverse los problemas de toxicidad y de estabilidad ante la acción de las proteasas (12).

Teniendo en cuenta que los péptidos actúan permeabilizando las membranas, pueden resultar tóxicos para las propias células humanas. Sin embargo, la presencia de esteroles en las membranas eucarióticas disminuye de forma importante la acción de los péptidos. Además, algunos péptidos pueden ser hemolíticos (11).

Debido a su pequeño tamaño y su amplio espectro de actividad, la indolicina se ha sugerido como un posible candidato para su uso terapéutico y se ha utilizado con éxito en formulación liposomal en un modelo de infección fúngica en ratones (42). Sin embargo, debido a su toxicidad se siguen buscando análogos que mantengan o mejoren su actividad y disminuyan la toxicidad, y mejoren, por lo tanto, las perspectivas de aplicación clínica (20). La utilización en liposomas puede servir para atenuar la toxicidad de determinados péptidos (43). También se pueden diseñar formas enantiómeras que permitan resistir la acción de las proteasas y tengan una vida media en suero más larga (44).

Tabla 5. Fase clínica en que se encuentran algunos péptidos con actividad antimicrobiana (12).

Compañía	Péptido	Indicación clínica	Estado de desarrollo
Magainin Pharmaceuticals	MSI-78 (hélicea) MSI-78	Impétigo Tratamiento tópico de las úlceras del pie del diabético	Abandonado después de fase III Fase III
Applied Microbiology/ Astra/Merck	Nisina (lantibiótico)	Infecciones por Helicobacter	Ensayos clínicos iniciales
Applied Microbiology/ Nippon Shoji	Variantes de nisina	Enterococos resistentes a vancomicina (parenteral)	Investigación preclínica
Micrologix Biotech	MBI-11CN MBI-20 (hélice a)	Infecciones por grampositivos Infecciones por gramnegativos, potenciador de antibióticos convencionales	Investigación preclínica Investigación y desarrollo
Intrabiotics	IB367 (lámina ß)	Tratamiento tópico de mucositis oral	Investigación preclínica
Xoma	Mycoprex (derivado BPI)	Candidiasis sistémicas como potenciador de actividad del fluconazol	Investigación preclínica

Se han realizado ensayos clínicos con el derivado de la magainina MSI-78, el pexiganan, como agente antiinfeccioso en úlceras de los pies en pacientes diabéticos (45) y para el tratamiento del impétigo (46). Se ha observado una reducción de 4 log de la flora de la piel perineal humana después de la aplicación tópica de MSI-78, y en dos ensayos clínicos en fase III con MSI-78 para el tratamiento de úlceras de pie del diabético infectadas se obtuvieron resultados similares a los logrados con ofloxacino oral en cuanto a resolución clínica de la infección (28).

En el tratamiento o la prevención de infecciones oculares se han utilizado análogos de cecropinas (47), híbridos cecropina A-melitina (48) o defensinas de conejo, especialmente NP-1 y NP-2 (32) para el tratamiento de las queratitis producidas por Pseudomonas. Además, se ha observado la actividad in vitro de las magaininas sobre Acanthamoeba polyphaga (9) y se ha propuesto a las defensinas como agentes preservativos en el medio de mantenimiento de las córneas previamente al trasplante (49). En un experimento in vivo realizado con un híbrido cecropina A-melitina en conejos infectados con P. aeruginosa, los péptidos fueron tan efectivos como la gentamicina para eliminar la infección.

Los péptidos también tienen su aplicación en las infecciones bucodentales. Concretamente, las defensinas son activas frente a muchas bacterias de la cavidad oral, aunque algunas como Actinobacillus actinomycetemcomitans y Eikenella corrodens son resistentes a la acción de las defensinas, pero no a las protegrinas. Se ha demostrado la eficacia in vivo de la histatina en un modelo de gingivitis experimental en perros (10).

La ambicina (nisina, un péptido catiónico lantibiótico) y el IB-367 (un péptido catiónico tipo protegrina) han tenido éxito en los ensayos clínicos de fase I (toxicidad). La nisina está siendo considerada para el tratamiento de las úlceras producidas por Helicobacter pylori y el IB-367 en forma de aerosol para pacientes con fibrosis quística (8, 11, 12). También se está considerando su utilización para el tratamiento de las infecciones asociadas a catéter y en casos de acné importante (8, 11, 12).

Por último, podemos destacar los estudios realizados con rBPI21, que aunque es una proteína catiónica de más de 200 aminoácidos, una pequeña porción peptídica catiónica presenta la misma actividad que la molécula completa. Esta proteína ha mostrado buena actividad en ensayos de fase II/III para el tratamiento de la meningococemia, con una reducción importante de la mortalidad y una excelente actividad antiendotoxina (8, 11).

CONCLUSIÓN

Los péptidos naturales tienen diferentes actividades sobre la mayoría de los microorganismos y presentan diversas ventajas:

– La CMI se encuentra, en general, entre 1 y 8 mg/l.

– Tienen actividad bactericida a una concentración de alrededor de la CMI.

– Producen efecto bactericida muy rápido, con reducción de 4 a 6 log en el número de colonias en los primeros cinco minutos a una concentración de cuatro veces la CMI.

– Su actividad no se ve afectada por los mecanismos de resistencia comunes a otros antibióticos.

– Es difícil seleccionar mutantes resistentes en el laboratorio.

Pero todavía presentan algunas dificultades que deben considerarse:

– La posible toxicidad, pues algunos de los péptidos naturales pueden ser hemolíticos y tóxicos.

– La estabilidad in vivo, que puede solventarse administrándolos junto con inhibidores de proteasas o modificando la estructura química de forma que no sean reconocidos por las proteasas.

– Los costes de producción, ya que la síntesis química es muy cara, pero podría utilizarse la síntesis recombinante (11).

Aunque todavía queda mucho camino por recorrer hasta que se puedan emplear estos péptidos antibióticos en infecciones graves producidas por bacterias multirresistentes, lo que se conoce hasta ahora es muy prometedor. En muchas circunstancias nos encontramos con infecciones producidas por microorganismos que se han hecho resistentes a prácticamente todos los antibióticos conocidos, y es necesario encontrar alternativas terapéuticas para estas infecciones. La teoría del uso clínico de los péptidos antibióticos consiste en aplicar los mismos mecanismos que han sido utilizados por numerosas especies de animales y plantas para defenderse de las agresiones sufridas por patógenos. Los trabajos que se sigan realizando en este campo permitirán la síntesis de nuevos compuestos o la modificación de los ya conocidos para que presenten una buena actividad antimicrobiana, aumentando su estabilidad y disminuyendo la toxicidad.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la financiación de dos proyectos de investigación relacionados con este tema: proyecto 99/0025 del FISS y proyecto CAM 08.2/0029.1/98 (Comunidad Autónoma de Madrid).

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