1998 Estrategias de inhibición de mecanismos de resistencia

Inhibición de mecanismos de permeabilidad y bombeo .

J.L. Martínez

Centro Nacional de Biotecnología (CSIC), Campus UAM, Cantoblanco, Madrid.

Uno de los mayores problemas para el tratamiento de las infecciones debidas a ciertas familias de bacterias es su baja sensibilidad intrínseca a distintos antibióticos. Esto es particularmente grave en el caso de patógenos oportunistas como Pseudomonas y otros géneros bacterianos filogenéticamente cercanos y que dan cuenta de un porcentaje elevado de las infecciones hospitalarias. El punto de vista tradicional indicaba que el motivo por el cual estas bacterias eran poco sensibles a los antibióticos era su baja permeabilidad a distintos compuestos (1).

Sin embargo, más recientementemente se ha visto que la explicación no es tan sencilla. A finales de los años 1980 se describió por vez primera la existencia de sistemas capaces de expulsar de un modo activo a los antibióticos hacia el exterior de las bacterias, y desde mediados de la presente década se ha venido caracterizando un número cada vez mayor de dichos sistemas. Los sistemas de bombeo de antibióticos en las bacterias gramnegativas constan de tres proteínas: una presente en la membrana citoplásmica, otra en la membrana externa y otra que actúa como unión entre ambas. El sistema está acoplado, para su funcionamiento, al potencial de membrana. En el caso de las bacterias grampositivas el sistema es más sencillo, con una única proteína implicada en el transporte de fármacos, cuya actividad es dependiente de ATP. Es de notar que estos sistemas de transporte son muy homólogos, tanto estructural como funcionalmente, a sistemas de transporte de fármacos implicados en la resistencia a agentes anticancerígenos. Otro aspecto importante de los sistemas de bombeo de antibióticos es que tienen un rango de sustrato muy amplio, recibiendo en consecuencia el nombre de Multi-Drug-Resistance systems (MDR) (2).

En cuanto a su distribución, hay sistemas que sólo están presentes en algunas cepas de una especie bacteriana, pero la gran mayoría se encuentran en el genoma de todos los individuos pertenecientes a dicha especie (3). En nuestro laboratorio hemos demostrado que los tres sistemas de bombeo descritos hasta el momento en P. aeruginosa están presentes tanto en cepas de origen clínico como de origen medioambiental (datos no publicados). Asimismo, hemos demostrado la existencia de sistemas MDR, inducibles por metales pesados, en enterobacterias de origen medioambiental (4). Esto da idea de que los sistemas de bombeo son ubicuos y, de hecho, el análisis de secuencias completas de microorganismos indica su presencia en los cromosomas de todas las bacterias caracterizadas. La única diferencia entre cepas resistentes y sensibles consiste en que, en las primeras, el sistema MDR se expresa de modo constitutivo como consecuencia de mutaciones en sus elementos reguladores. Por otra parte, a pesar de que los sistemas MDR no se expresan en condiciones habituales de cultivo en el laboratorio, cabe destacar que han de tener una función in vivo. Su expresión ha de ser inducible bajo ciertas condiciones, y esto puede producir fenómenos de resistencia fenotípica en el punto de la infección, no detectables mediante técnicas rutinarias de análisis en el laboratorio (5).

El hecho de que los sistemas MDR sean ubicuos e intervengan en el bombeo de numerosos antibióticos los convierte en blancos ideales para la búsqueda de nuevos inhibidores bacterianos, capaces de hacer a las bacterias que portan estos sistemas más sensibles a los antibióticos actualmente existentes en el repertorio clínico. Se ha determinado también que mutantes de Escherichia coli y P. aeruginosa en los cuales se han inactivado sistemas MDR se hacen más sensibles a distintos antibióticos. Estos datos indican que los inhibidores de sistemas MDR pueden tener interés terapéutico, y no sólo para el tratamiento de la infeccion, sino para evitar la emergencia de mutantes resistentes que requieran una doble mutación para producir su fenotipo. En este sentido se ha descrito que el tratamiento con reserpina, un inhibidor de los sistemas de bombeo de bacterias grampositivas, disminuye la frecuencia de emergencia de mutantes resistentes a las quinolonas en dichas bacterias (6). Por otra parte, se ha visto que en la mayor parte de los aislamientos clínicos la resistencia a las quinolonas está asociada a la presencia de mutaciones en topoisomerasas conjuntamente con una sobreexpresión de sistemas MDR, lo cual indica que probablemente son necesarias ambas mutaciones para dar lugar a una resistencia de relevancia clínica (7).

A pesar del interés que pueden tener, no existen todavía inhibidores de sistemas de bombeo con aplicación terapéutica, aunque hay compañías farmacéuticas que están trabajando de modo muy activo para conseguirlos. Los futuros inhibidores podrían ser de tres clases:

a) Inhibidores de la fuente de energía requerida para el funcionamiento de los sistemas MDR: inhibidores del potencial de membrana (CCCP) o de la actividad ATPasa (reserpina) que se utilizan en el laboratorio en la actualidad para caracterizar los sistemas MDR, pero su alta toxicidad hace que no sean adecuados para uso terapéutico.

b) Inhibidores directos de las bombas: moléculas que interaccionarían con las bombas inactivándolas irreversiblemente de un modo semejante a los inhibidores de betalactamasas. En nuestro grupo hemos obtenido anticuerpos específicos contra un sistema de bombeo de Stenotrophomonas maltophilia y su uso permite disminuir los valores de CMI de distintos antibióticos.

c) Inhibidores de los sistemas reguladores de la expresión de las bombas. La expresión de los sistemas MDR tiene una regulación compleja que se conoce poco. Se sabe, por ejemplo, que en algunos casos su expresión se activa por salicilato. La utilización de análogos estructurales capaces de unirse al activador, pero impidiendo que actúe como tal, podrían ser de utilidad para la inhibición de los sistemas MDR.

Como resumen cabe destacar que el desarrollo de inhibidores de MDR prodría contribuir de modo muy significativo a mejorar la actividad de los antibióticos que se utilizan en la actualidad. Dado que los sistemas MDR tienen una funcionalidad, que no conocemos, distinta de la resistencia a antibióticos, estos inhibidores incluso podrían tener una actividad antibacteriana directa.

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Mecanismos de inhibición debetalactamasas.

M.J. Fresnadillo

Departamento de Microbiología, Hospital Universitario, Salamanca.

La producción de betalactamasas constituye el principal mecanismo de resistencia a los antibióticos betalactámicos, fundamentalmente en gramnegativos, y ha motivado que gran parte de los esfuerzos, en el ámbito de estos antimicrobianos, se haya centrado en el diseño de estrategias encaminadas a neutralizar y contrarrestar su acción. Las desarrolladas hasta la actualidad incluyen la síntesis de análogos estables a la degradación enzimática, el desarrollo de preparados con poca afinidad por las betalactamasas, el empleo de sustancias bloqueantes y la utilización de inhibidores de betalactamasas en combinación con "auténticos antimicrobianos", a los que protegen de la inactivación enzimática.

Las primeras aproximaciones en la lucha contra las betalactamasas se realizaron durante los años 1940 y 1950, e incluyeron el empleo de un suero antibetalactamasa (1) y de diversos compuestos orgánicos (laurilsulfato, benzoato y sulfanilato sódicos, xilocaína, 2 bencilimidazol, etc.), pero los resultados fueron desalentadores (2) (incluso, en el caso del suero antibetalactamasa, se produce una activación de determinadas enzimas) (3) y no se logró encontrar ningún agente clínicamente utilizable. El descubrimiento de la cefalosporina C (4) y de las primeras penicilinas semisintéticas (meticilina, nafcilina e isoxazolpenicilinas) marca el verdadero comienzo del desarrollo de los inhibidores de betalactamasas, ya que se muestran estables a la hidrólisis y actúan como inhibidores competitivos al asociarse a un betalactámico lábil. Sin embargo, esta estrategia carece de utilidad práctica porque las penicilinas antiestafilocócicas atraviesan con gran dificultad la pared de los bacilos gramnegativos y por tanto no llegan al espacio periplásmico, donde se encuentran las enzimas. A pesar de este "fracaso", los resultados obtenidos animaron a diversos grupos de investigadores a dirigir sus esfuerzos a la búsqueda de moléculas con capacidad inhibitoria frente a las betalactamasas. Así, en 1967 se inicia en los Laboratorios Beecham un programa de investigación encaminado a detectar metabolitos microbianos con actividad inhibitoria de betalactamasas, que tuvo como consecuencia el descubrimiento de los ácidos olivánicos a partir de una cepa de Streptomyces olivaceus (5) y del ácido clavulánico producido por Streptomyces clavuligerus (cepa ATCC 27064) (6). El ácido clavulánico muestra escasa actividad antimicrobiana pero una importante capacidad de inhibir algunas betalactamasas, por lo que se convirtió en el prototipo de molécula con dicha función y "validó" la eficacia de esta estrategia.

Con posterioridad se descubrieron otros inhibidores: en 1978 el sulbactam (Barth en laboratorios Pfizer), en 1980 la sultamicilina (Bigham) (un doble éster o profármaco mutuo de sulbactam y ampicilina) y en 1984 el tazobactam (Micetich para laboratorios Taiho). Los derivados halogenados del ácido penicilánico, ácidos 6b-bromo (brobactam) y 6ß-iodo penicilánico también son buenos inhibidores de betalactamasas, comparables al ácido clavulánico, aunque aún no se han introducido en clínica. El ácido 6b-cloro penicilánico posee menor capacidad de inhibición. Sin embargo, la diana prioritaria de todas estas moléculas son las betalactamasas de la clase A, por lo que la investigación continúa, fundamentalmente encaminada hacia la búsqueda de moléculas con actividad frente a las clases B y C. Así, los últimos compuestos estudiados, todos con estructura betalactámica y pertenecientes a diferentes grupos [carbacefémicos (RO 485545, RO488724, RO 488391), sulfonas del ácido penicilánico (SYN 1849, SYN 1852, SYN 1903, RO 481220, RO 481256, CL 186190, GD 40), derivados halogenados (GD 40), monobactámicos (RO 481256, EP 508234, JP 93186468, SYN 2190), etc.] muestran una capacidad inhibitoria frente a las betalactamasas plasmídicas y cromosómicas de la clase C mayor que la del ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam, y se han descrito compuestos (LL10G568a, LL10G568b, diferentes derivados del ácido mercaptoacético) que inhiben metaloenzimas hidrolizantes de carbapenémicos y cefamicinas (betalactamasas de la clase B) (7-10).

Las moléculas que actúan como inhibidores de betalactamasas pueden hacerlo según un mecanismo competitivo, si el inhibidor y el sustrato (betalactámico sensible a betalactamasas) compiten por el lugar activo de la enzima, o no competitivo. La inhibición competitiva tiene lugar con moléculas que poseen estructura química betalactámica. Puede producirse por dos mecanismos fundamentales: formación de complejos enzima-sustrato sin o con interacciones químicas (reversible e irreversible) y "bloqueo " por sustratos "pobres" o "perezosos" que son degradados muy lentamente (sustratos competitivos). Se comportan de esta forma las penicilinas antiestafilocócicas (meticilina, nafcilina e isoxazolpenicilinas), la temocilina, las cefamicinas, el aztreonam, los carbapenémicos, etc. (10).

A su vez, la inhibición puede ser reversible si la enzima recupera su acción después de desligarse del inhibidor (isoxazolpenicilinas) e irreversible si la enzima permanece inactiva incluso después de liberarse del inhibidor, debido a que se produce una alteración química y conformacional de la enzima. A este último grupo pertenecen diversas sustancias que reaccionan covalentemente con aminoácidos de la enzima, inhibidores dirigidos al grupo activo de la enzima y un grupo conocido como inhibidores "suicidas" porque en el proceso se autodestruyen. El ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam se comportan eminentemente como inhibidores suicidas, aunque sus características cinéticas pueden verse modificadas dependiendo de la enzima. El tipo de inhibición que producen es, a su vez, competitiva por motivos estructurales, selectiva y progresiva en función del tiempo y de la concentración de inhibidor (11).

El primer paso de la reacción entre betalactamasa e inhibidor suicida es el posicionamiento de la molécula del inhibidor en el centro activo de la enzima. El inhibidor y el grupo catalítico no sólo deben estar próximos sino también alineados convenientemente, de modo que pueda formarse un complejo previo a la acilación. Las uniones son débiles y se establecen mediante puentes de hidrógeno y uniones electrostáticas, por lo que este complejo tiene carácter reversible. El ataque nucleofílico del grupo carbonil del inhibidor por el OH de la serina 70 en conjunción con los radicales activos del glutámico 166, la lisina 73, la serina 130 y la lisina 234 (en las betalactamasas del grupo A) y la posterior rotura del anillo no betalactámico dan lugar a la formación de un complejo covalente acil-enzima, a varios compuestos de transición y a compuestos lineales, sin actividad enzimática e irreversibles debido a la ausencia de un paso de desacilación, existente en el ataque a sustratos sensibles, necesario para la regeneración de la enzima (12-14).

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Mecanismos de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas.

J. Blázquez

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

La hidrólisis enzimática, las mutaciones en las dianas (PBP), las bombas de flujo y las mutaciones que impiden o reducen la entrada del antibiótico constituyen los principales mecanismos de resistencia a los antibióticos betalactámicos en las bacterias patógenas. A pesar de la diversidad de mecanismos, el más común es la presencia de enzimas capaces de hidrolizar el anillo betalactámico, las betalactamasas, y convertir a estos antibióticos en inactivos. Durante años se ha tratado de evitar la resistencia a los betalactámicos mediante el desarrollo de nuevas moléculas, ya sean resistentes a la hidrólisis (como las cefalosporinas de tercera generación) ya sean inhibidoras de la actividad hidrolítica (como el ácido clavulánico). La evolución y diseminación de las betalactamasas parece ser consecuencia de la evolución y el consumo de antibióticos betalactámicos. La gran cantidad de variantes de betalactamasas que existe da idea de la enorme presión selectiva a que han sido sometidas. Se conocen, por ejemplo, más de 60 variantes de betalactamasas de tipo TEM, fruto solamente de entre uno y cinco cambios en las secuencias de TEM-1 o TEM-2 (1, 2). Con estos pocos cambios, las betalactamasas de tipo TEM son capaces de ampliar su espectro de sustratos (betalactamasas de espectro ampliado, BLEA), hidrolizando las nuevas moléculas desarrolladas precisamente para evitar dicha hidrólisis.

Como en el caso de las cefalosporinas de tercera generación, las bacterias patógenas han respondido al desarrollo y uso de los inhibidores de betalactamasas. La resistencia a los inhibidores de betalactamasas en patógenos productores de este tipo de enzimas se debe principalmente a dos mecanismos: betalactamasas variantes con sensibilidad disminuida (3) o hiperproducción de la enzima (4). Además, estos dos mecanismos pueden aparecer unidos a otros, como una disminución de la entrada del inhibidor y la presencia de bombas de flujo. De forma similar a las BLEA, uno o varios cambios en determinadas posiciones de estas enzimas las convierten en más resistentes a la acción de los inhibidores. Hasta hace muy poco, la resistencia a las nuevas cefalosporinas y la resistencia a los inhibidores se encontraba segregada en este tipo de enzimas. Incluso, y debido a los resultados obtenidos en el laboratorio con genes híbridos, se pensó en la imposibilidad de la coexistencia de los dos tipos de mutaciones en la misma molécula de proteína. Desgraciadamente ya se ha descrito la primera betalactamasa de tipo TEM con actividad aumentada contra las cefalosporinas de tercera generación y sensibilidad disminuida a los inhibidores de betalactamasas (5). La experiencia de los últimos años nos demuestra que, debido a la gran capacidad de variación y adaptación que poseen los microorganismos, es muy posible que estas betalactamasas mutantes se encuentren con frecuencia en un futuro y que además sean cada vez más eficaces.

El mundo microbiano ha sabido responder a cada una de las estrategias empleadas para luchar contra la producción de betalactamasas. Sin embargo, a pesar del desarrollo de un enorme número de variantes enzimáticas, las bacterias poseen aún otro recurso: las betalactamasas de clase C. Estas enzimas, codificadas en el cromosoma de muchos gramnegativos y de la mayor parte de las enterobacterias, poseen la capacidad de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación y son, además, naturalmente resistentes a la inhibición por los inhibidores clásicos. Además, la producción de la mayoría de estas enzimas es inducible indirectamente por la acción de los betalactámicos, e incluso por los inhibidores de betalactamasas. El ácido clavulánico, por ejemplo, ejerce una acción paradójica sobre la producción de la enzima AmpC en algunos gramnegativos como Enterobacter cloacae: a pesar de inhibir sólo débilmente la actividad de AmpC, es capaz de inducir la transcripción del gen (AmpC) que codifica para la betalactamasa cromosómica. La creciente aparición de aislamientos clínicos portadores de betalactamasas de tipo AmpC codificadas en plásmidos (6), y por lo tanto transmisibles entre diferentes cepas, junto con el aislamiento de las primeras variantes naturales de AmpC con actividad incrementada contra cefalosporinas (7, 8), complica todavía más el panorama para los antibióticos betalactámicos y los inhibidores de betalactamasas. Además, se ha demostrado que no se puede descartar la aparición de variantes de AmpC capaces de conferir resistencia a las cefalosporinas de cuarta generación (9). Se hace necesario, por lo tanto, el desarrollo de nuevas moléculas inhibidoras que actúen sobre las betalactamasas de tipo AmpC. Para ser completamente eficaces, estas nuevas moléculas no deberían ser afectadas por los mecanismos habituales de resistencia a los inhibidores betalactámicos, como mutaciones en porinas, bombas de flujo y adquisición de mutaciones enzimáticas que disminuyan la afinidad por la molécula. Según esto, parece adecuado el estudio y desarrollo de inhibidores no betalactámicos de betalactamasas de tipo AmpC (10).

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Farmacodinamia y actividad no enzimática de los inhibidores de betalactamasas

L. Aguilar1, M.J. Giménez1 y M. Gómez-Lus2

1Departamento Médico, SmithKline Beecham, S.A., Madrid; 2Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid.

El objetivo de la farmacodinamia como disciplina es estudiar las interacciones de fármaco y diana (1). En el caso de los inhibidores de betalactamasas, como su propio nombre indica, la diana de actuación es dicha enzima bacteriana. Sin embargo, para completar el estudio de la acción de estos compuestos, entre los que cabe destacar al ácido clavulánico, como estrategia de inhibición de los mecanismos de resistencia bacterianos, parece necesario explorar su acción sobre la diana celular, a pesar de su nulo efecto antibacteriano clásico propio (2), así como el efecto sobre la acción de los fagocitos polimorfonucleares como primera línea de defensa antibacteriana.

Desde un punto de vista farmacodinámico se ha investigado la acción antienzimática del ácido clavulánico (efecto de concentraciones variables que simulan las concentraciones séricas obtenidas a lo largo del intervalo de dosificación) sobre la actividad betalactamasa bacteriana considerando tres aspectos:

1) Decremento de la actividad betalactamasa a lo largo del tiempo. Este decremento se obtuvo con ácido clavulánico, a pesar del mantenimiento de la viabilidad bacteriana, en experimentos realizados con Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus (3).

2) Efecto postbetalactamasa (definido como decremento de la actividad betalactamasa con respecto a un control tras la desaparición del inhibidor del medio). El ácido clavulánico ha demostrado presentar un efecto postbetalactamasa superior a cuatro horas para H. influenzae y S. aureus (3).

3) Mantenimiento del efecto postantibiótico por el efecto postbetalactamasa (anteriormente definido) y la presencia de concentraciones subinhibitorias del antibiótico, traduciéndose en un mantenimiento del decremento de la viabilidad bacteriana a lo largo del tiempo (S. aureus sensible y resistente a meticilina) (4, 5).

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico sobre la diana celular que han sido detenninadas son:

1) Retraso con respecto al control en el tiempo de generación de S. aureus (4) y Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina (6).

2) Aumento del enlentecimiento del crecimiento de S. pneumoniae producido por concentraciones subinhibitorias de amoxicilina (7).

3) Incremento de la velocidad y la magnitud de la actividad bactericida de la amoxicilina frente a S. pneumoniae resistente a penicilina (7).

4) Aumento de la velocidad de acción bactericida de la amoxicilina sobre la subpoblación resistente de S. aureus heterorresistente (5).

5) Disminución de la CMI de amoxicilina en cepas de H. influenzae no productor de betalactamasa que presentan elevada CMI (8).

Por último, el efecto del ácido clavulánico sobre la acción de los polimorfonucleares en una cepa de S. pneumoniae resistente a penicilina, en presencia de suero humano no inactivado, ha sido estudiada con respecto a:

1) Decremento del inóculo inicial de S. pneumoniae resistente a penicilina en presencia de polimorfonucluares, suero humano y concentraciones fisiológicas de ácido clavulánico (6).

2) Decremento de la viabilidad bacteriana de S. pneumoniae resistente a penicilina por concentraciones subinhibitorias de amoxicilina-ácido clavulánico en presencia de polimorfonucleares y suero humano (7).

3) Consecución de actividad bactericida (definida como una reducción >99% del inóculo inicial) frente a S. pneumoniae resistente a penicilina por parte de concentraciones fisiológicas de amoxicilina-ácido clavulánico tras una hora de incubación en presencia de polimorfonucleares y suero humano (7).

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico sobre S. pneumoniae se basan en la acción de éste sobre la PBP3 (diana no lítica) (9), desestructurando la pared y favoreciendo la actuación de la amoxicilina, la opsonofagocitosis y la muerte intracelular por lisozima (10)..

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico en presencia o ausencia de factores defensivos del huésped podrían explicar el recientemente descrito (11) aumento de la actividad in vivo frente a S. pneumoniae de amoxicilina-ácido clavulánico en comparación con amoxicilina.

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Problemas de la detección de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasasen el laboratorio

F.J. Castillo García

Servicio de Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Zaragoza.

Aunque hay varios mecanismos bioquímicos que pueden explicar la resistencia a los betalactámicos en los bacilos gramnegativos, la biosíntesis de betalactamasas es el más importante. Para superar este problema una de las estrategias más eficaces consiste en la combinación de betalactámicos con inhibidores suicidas de betalactamasas. Así disponemos en la clínica de diferentes inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam) que son particularmente activos frente a las betalactamasas plasmídicas.

La resistencia a la asociación de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas fue descrita por primera vez en nuestro país en 1987 (5). Circunscrita inicialmente a Escherichia coli, se ha observado más recientemente en algunas cepas de Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri y Haemophilus influenzae (7, 12). En E. coli, especie en la que sin duda la resistencia ha alcanzado una mayor difusión, se han descrito varios mecanismos causantes de la disminución de sensibilidad a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas:.

1) Hiperproducción de betalactamasa cromosómica del grupo 1, que es menos sensible que las enzimas del grupo 2 a la acción de los inhibidores de betalactamasas. En algunas cepas la producción de esta betalactamasa está constitutivamente desreprimida por mutaciones en AmpC o por la adquisición de un promotor más fuerte (13). La existencia de cepas que han adquirido la capacidad de producir AmpC vía plásmidos a partir del cromosoma de otras bacterias, tales como Citrobacter sp. o Enterobacter sp., puede expandir en el futuro este mecanismo de resistencia.

2) Algunas betalactamasas plasmídicas, como OXA-1, son menos sensibles que las betalactamasas tipo TEM a la inhibición por inhibidores de betalactamasas, de modo que las cepas que producen estas enzimas son con más frecuencia resistentes a las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas (15).

3) La hiperproducción de betalactamasas plasmídicas de amplio espectro del grupo 2b no modificadas (TEM-1, TEM-2, SHV-1) es un mecanismo muy frecuente de resistencia, que puede deberse a la presencia de plásmidos multicopia o a la existencia de un promotor más potente (8, 10).

4) La modificación en las proteínas de membrana externa OmpF y/o OmpC, que limitan la penetración de las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas, en conjunción con la producción de betalactamasas también confieren resistencia (10).

5) Desde que se identificaron por primera vez en 1989, en Francia y en España (1, 2), se han descrito numerosas mutantes de TEM-1 o TEM-2 (TEM-30 a TEM-41, TEM-44, TEM-45) con modificaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de la enzima que se traducen en una sensibilidad sustancialmente reducida frente a los inhibidores de betalactamasas. Solo hay un informe de un aislamiento clínico en Grecia que posea una IRBL derivada de SHV, la SHV-10 (9). Pertenecen al grupo 2br y se las conoce con el nombre de IRT (inhibitor resistant TEM) o IRBL (inhibitor resistant TEM betalactamases).

Mientras que los mecanismos de resistencia de las otras categorías se encuentran prácticamente circunscritos a E. coli, el potencial de difusión epidémica inherente a un mecanismo de codificación plasmídica, como es la síntesis de IRBL, representa un peligro considerablemente mayor para la actividad de las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas.

Estudios epidemiológicos llevados a cabo en diferentes países europeos han evidenciado que la frecuencia de cada mecanismo de resistencia varía de unas zonas a otras, lo que podría estar en relación con el diferente uso que se hace de los antibióticos betalactámicos en los distintos países (12). La vigilancia en el laboratorio de microbiología clínica del estado de la resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas y el conocimiento de los mecanismos involucrados son fundamentales para garantizar la eficacia clínica e influir en el uso de los diferentes antibióticos betalactámicos en la comunidad y en el medio hospitalario. Ahora bien, para conseguir este objetivo existen algunas dificultades, como la variabilidad en los resultados consecuencia de las diferencias existentes en la metodología utilizada por los distintos laboratorios. Este problema adquiere más importancia si consideramos la relativa frecuencia con que las cepas presentan una disminución de sensibilidad más que valores de CMI pertenecientes a la categoría de resistentes, lo que puede llevar a subestimar la importancia real del problema (13).

La metodología usada para probar la sensibilidad bacteriana a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y en particular a amoxicilina-ácido clavulánico, no está universalmente homologada. Ello lleva a probar este compuesto tanto con una concentración fija de ácido clavulánico (2 µg/ml) como manteniendo una proporción 2:1 entre la amoxicilina y el ácido clavulánico. Cuando se prueban las mismas cepas en las mismas condiciones los resultados varían notablemente según se use la concentración fija o la proporcional del inhibidor. Así, con la relación 2:1 siempre se obtiene mayor porcentaje de cepas sensibles (14). Por tanto, este método puede subestimar el índice global de resistencia y, eventualmente, inducir algún fracaso terapéutico. Si queremos vigilar eficientemente la aparición de cepas portadoras de IRBL, conviene no olvidar que su detección es más probable si se usa una concentración fija de inhibidor en las pruebas de sensibilidad (14).

La lectura interpretativa del fenotipo de resistencia constituye un método universalmente asequible y puede resultar muy útil, al menos para hacer una selección preliminar de las cepas que nos ayude a sospechar el mecanismo de resistencia involucrado y a elegir el método de confirmación que sea necesario.

Cuando la resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas se debe a la sobreproducción de la cefalosporinasa cromosómica del grupo 1, el patrón de resistencia incluye aminopenicilinas, amoxicilina-ácido clavulánico, cefalosporinas de primera y segunda generación y cefamicinas. Se elevan discretamente las CMI de las carboxipenicilinas y ureidopenicilinas, y pueden encontrarse cepas con sensibilidad disminuida a todos los betalactámicos excepto los carbapenémicos (11). La cloxacilinasa OXA-1 no es tan bien inhibida como la TEM-1 por los diferentes inhibidores de betalactamasas. La hiperproducción de esta enzima, además de elevar la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico, disminuye la sensibilidad a la cefpiroma (2-8 µg/ml) y a la cefotaxima (0,5-2 µg/ml), sin afectar a la ceftazidima ni al aztreonam (6). Se puede sospechar su presencia en cepas resistentes a aminopenicilinas, carboxipenicilinas y asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y en sensibles a cefalotina (15). El fenotipo de las cepas hiperproductoras de betalactamasas del grupo 2b incluye CMI muy elevadas para aminopenicilinas, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas y en menor grado para la amoxicilina-ácido clavulánico y las cefalosporinas de primera y segunda generación.

Puede producirse también un ligero aumento de las CMI de ceftazidima y aztreonam (6).

Las cepas productoras de IRBL son resistentes a las penicilinas de amplio espectro, solas y en combinación con inhibidores de betalactamasas. Se mantienen sensibles a las cefalosporinas de primera y segunda generación y a las cefamicinas. La resistencia a amoxicilina-ácido clavulánico, junto con la sensibilidad completa a la cefazolina y la cefoxitina, sugieren la presencia de un mecanismo enzimático de resistencia diferente de la hiperproducción de TEM o de las alteraciones de la membrana (2, 3).

La determinación del punto isoeléctrico (pI) mediante isoelectroenfoque analítico es de gran ayuda para confirmar la interpretación fenotípica. Así, las betalactamasas TEM-1, TEM-2 y OXA-1 tienen pI de 5,4, 5,6 y 7,4, respectivamente. Las IRBL tienen pI de 5,4 o 5,2 y las cepas hiperproductoras de betalactamasa cromosómica tienen pI superiores a 8 (3, 4, 13).

Más complicada y laboriosa resulta la determinación de los parámetros cinéticos de las diferentes betalactamasas, así como la secuenciación y la oligotipificación de los genes que codifican la betalactamasa, que resulta obligada para definir las sustituciones en la secuencia de los aminoácidos y con ello la identificación de IRBL conocidas y la caracterización de nuevas enzimas. Recientemente se ha descrito una técnica de biología molecular capaz de detectar modificaciones genéticas, que utilizando un amplio grupo de enzimas como patrón permite una rápida identificación de los genes plasmídicos implicados en la resistencia enzimática a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas en enterobacterias (12).

La presencia en una cepa de diversos mecanismos de resistencia al mismo antimicrobiano no es un hecho infrecuente y, sin duda, complica su estudio. Así, cepas productoras de betalactamasas de espectro ampliado a menudo producen también betalactamasas tipo TEM o SHV, y si estas enzimas clásicas se sintetizan en suficiente cantidad pueden producir resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas y con ello fenotipos de más difícil lectura. Recientemente ha sido identificada en Francia (11) una mutante compleja de la betalactamasa TEM-1 con mutaciones localizadas tanto en la IRBL TEM-33 como en la betalactamasa de espectro ampliado TEM-15 en una cepa de E. coli. Esta enzima confiere resistencia de muy bajo grado a los inhibidores de betalactamasas y de bajo grado a las cefalosporinas de espectro ampliado. Además, el test de sinergia de doble disco fue débilmente positivo. Presentaba por tanto un fenotipo inusual, que inicialmente sugería la presencia de varias betalactamasas o la combinación de diferentes mecanismos de resistencia a betalactámicos, cuando en realidad se trataba de una mutante compleja que combina mutaciones causantes de resistencia a los inhibidores (Leu-69 y Asp-276) y mutaciones causantes de actividad de espectro ampliado (Lis-104 y Ser-238). Es posible que estas mutantes no sean muy rentables para los microorganismos que las albergan, ya que probablemente fuera más beneficioso para la cepa portadora producir simultáneamente dos mutantes de TEM diferentes, una de espectro ampliado y otra IRBL, que producir una mutante doble. Si cada mutante confiriera su propio fenotipo de resistencia, podría esperarse resistencia de alto grado tanto a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas como a las cefalosporinas de espectro ampliado (11).

Bibliografía

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Evolución de la resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas.

J.I. Alós

Servicio de Microbiolobía, Hospital de Móstoles, Madrid.

Desde la década de 1980 se han usado las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas para restablecer la actividad de los betalactámicos frente a patógenos tan importantes en humanos como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, al poco de la introducción en clínica de las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, e incluso antes, se encontraron cepas de E. coli resistentes a la amoxicilina-ácido clavulánico. En E. coli existen varios mecanismos de resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas. Uno de ellos es la producción de cantidades elevadas de la betalactamasa TEM-1, la mas común en esta especie, generalmente debida a pequeños plásmidos multicopia o a mutaciones en el promotor. Alteraciones de la permeabilidad por modificación de las porinas junto con una producción "normal" de TEM-1 constituyen otro mecanismo. Otra posibilidad es la hiperproducción de su betalactamasa cromosómica, al no ser ésta sensible a los inhibidores de betalactamasas. También se ha descrito la producción de betalactamasa plasmídica del tipo OXA-1, mucho menos sensible a la inhibición por los inhibidores de betalactamasas que las del tipo TEM o SHV. Por último, en años recientes han surgido betalactamasas con afinidad disminuida por los inhibidores de betalactamasas (betalactamasas resistentes a inhibidores, BLRI). Las BLRI presentan propiedades cinéticas alteradas en su interacción tanto con los betalactámicos como con los inhibidores de betalactamasas. Los primeros ejemplos de BLRI se dieron en mutantes conseguidos en el laboratorio con oligonucleótidos degenerados. Las enzimas, derivadas de TEM-1, presentaban sustituciones de la metionina de la posición 69 (esquema de numeración de Ambler) por aminoácidos alifáticos hidrófobos tales como la leucina, la valina o la isoleucina. Poco después se aislaron de muestras clínicas las primeras cepas con BLRI. En E. coli han surgido como resultado de mutaciones únicas o múltiples en los genes estructurales de las betalactamasas TEM-1 y TEM-2 y, más raramente, de SHV y de OXY. En aquéllas derivadas de TEM-1 o de TEM-2, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 69, 244, 275 y 276, solas o en combinación con otras, se consideran la causa de la resistencia a los inhibidores de betalactamasas.

En E. coli la incidencia y los mecanismos de resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas varían mucho según el lugar geográfico. En un estudio realizado en Londres con cepas aisladas entre 1990 y 1994 se encontró que aproximadamente el 5% (el 10% a 15% de las resistentes a ampicilina) eran resistentes o intermedias a amoxicilina-ácido clavulánico y que había pocos cambios en esos cinco años. El principal mecanismo era la hiperproducción de TEM-1 (el 61% de las cepas), seguido de la producción de OXA-1 (el 15%) y de la hiperproducción de betalactamasa cromosómica (el 13%), siendo raras las BLRI. En Francia, en 1993, casi un 25% de los E. coli aislados de orina en un hospital y un 10% de la comunidad eran resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. La cuarta parte de los del hospital y casi la mitad de la comunidad presentaban un patrón de antibiograma sugestivo de la presencia de BLRI, que confirmaron con métodos moleculares. Posteriores estudios sobre éstas y otras cepas demostraron la diversidad de clones, definidos por ribotipificación, y la gran diversidad de genes que codifican BLRI derivadas de TEM causantes de resistencia. En España, un 20% a 33% de los aislamientos de E. coli extrahospitalarios no son sensibles a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, aunque en nuestra experiencia actual (1998) es rara la presencia de BLRI.

En otras especies de bacilos gramnegativos importantes en clínica, como K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis y Citrobacter freundii, también se han encontrado recientemente BLRI. En EE.UU. se han descrito varias cepas de H. influenzae productoras de betalactamasa y resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. Aunque el mecanismo exacto no se conoce, hay que tener en cuenta que TEM-1 es la betalactamasa más frecuente en esta especie, por lo que no sería de extrañar la presencia de BLRI.

Las bacterias con betalactamasas TEM-1, TEM-2, SHV-1 y OXY sufrieron una fuerte presión selectiva al introducirse en clínica las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y como consecuencia hubo una evolución convergente por mutaciones en los genes estructurales de esas betalactamasas que dio lugar a las BLRI. Su posible extensión debe vigilarse constantemente en estudios epidemiológicos que las busquen por métodos fenotípicos y las caractericen por métodos moleculares.

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Reevaluación de los efectos gastrointestinales delos betalactámicos-inhibidores de betalactamasas

B. Sádaba

Servicio de Farmacología Clínica, Clínica Universitaria, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona

Ha sido necesario el desarrollo de inhibidores de betalactamasas, una familia de enzimas que pueden hidrolizar el anillo betalactámico, para devolver e incluso mejorar la actividad antimicrobiana de diferentes antibióticos betalactámicos. Hoy en día este grupo de fármacos lo constituyen tres compuestos, el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam, con diferencias en cuanto a su potencia inhibidora. Comercializadas en España existen las asociaciones ácido clavulánico-amoxicilina, tazobactam-piperacilina y sulbactam-ampicilina. La primera puede administrarse por vía oral o parenteral y las dos últimas solo por vía parenteral.

La asociación de estos inhibidores a los betalactámicos, además de modificar su espectro antimicrobiano, también puede tener repercusión sobre la tolerabilidad de estos fármacos, aunque es difícil valorar los efectos secundarios de estos inhibidores de betalactamasas debido a que nunca se administran solos, sino en asociación con dosis mucho más altas que las de los propios inhibidores.

Según las fichas técnicas de los productos, los efectos adversos de estas asociaciones son:

Tipo Amoxilicina-
ácido clavulánico		 Tazobactam-
piperacilina		 Sulbactam-
ampicilina
Gastrointestinales:
Diarrea
Náuseas-vómitos
Colitis pseudomembranosa
 5-10%
1-5%
Excepcional		 3.8%
0,3-0,4%
Excepcional		 Más_frecuente
Frecuente
Excepcional
Inmunológicas:
Enfermedad del suero
Anafilaxia
 1-7%
0,01-0,05%		 Ocasionalmente
0,01-0,05%		 1-7%
0,01-0,05%
Sanguíneas:
Eosinofilia
Leucocitopenia
 2-20%
Excepcional

Raramente

Raramente
Dermatológicas:
Exantema+prurito
 2-10% 2-10%
Tromboflebitis
 – 0,2-0,3% –

En el caso del betalactámico solo, sin asociación con el inhibidor, las reacciones adversas recogidas en la ficha técnica son las siguientes:

Tipo Amoxilicina Piperacilina Ampicilina
Gastrointestinales:
Diarrea
Náuseas-vómitos
Colitis pseudomembranosa
 1-5%
1-4%
Excepcional		 1-3%
1-4%
Excepcional		 10-18%
1-4%
0,4-0,7%
Inmunológicas:
Enfermedad del suero
Anafilaxia
 1-7%
0,01-0,05%		 Ocasionalmente
0,01-0,05%		 1-7%
0,01-0,05%
Sanguíneas:
Eosinofilia
Leucocitopenia
 2-20%
Raramente		 2-8%
Raramente		 2-50%
Raramente
Dermatológicas:
Exantema+prurito
 2-10% 1-4% 2-10%
Tromboflebitis
 – 3-6% Ocasionalmente

Si nos ceñimos a las reacciones adversas gastrointestinales puede observarse que existen diferencias en la frecuencia de aparición según se considere el betalactámico solo o en asociación con el inhibidor de betalactamasas. Hasta la fecha no se han realizado estudios comparativos entre el betalactámico y su asociación con un inhibidor, pero se ha intentado estudiar este efecto desde las reacciones adversas recogidas en los sistemas de farmacovigilancia desarrollados en muchos países, basados en la comunicación voluntaria de estos sucesos.

Dentro de las reservas con que deben asumirse estas conclusiones, parece claro que existe una mayor incidencia de diarrea en los pacientes tratados con amoxicilina-ácido clavulánico que en los tratados con amoxicilina sola, por vía oral, considerándose una probabilidad de aparición 2,36 superior (1).

Entre los efectos adversos gastrointestinales, los comunicados con mayor frecuencia son la diarrea y las náuseas. Aunque la manifestación más grave es la colitis pseudomembranosa, su aparición durante el tratamiento con este grupo de fármacos es excepcional. Por tanto, son otros los motivos de desarrollo de esta alteración durante el tratamiento con betalactámicos asociados a inhibidores de betalactamasas.

Dos son las causas que se consideran en el desarrollo de estos procesos: por una parte la alteración de la flora gastrointestinal saprófita y por otra la producción de trastornos en la motilidad intestinal.

En diferentes estudios se ha observado la aparición de diarrea con aislamiento de diversos microorganismos en heces, debido a la eliminación de parte de la flora saprófita por antibióticos de amplio espectro. Estos hallazgos se evidencian sobre todo en el caso de antibióticos con actividad frente a bacterias anaerobias, puesto que éstas poseen un efecto inhibidor sobre microorganismos potencialmente patógenos. Cuando un antibiótico administrado por vía oral no se absorbe completamente, el riesgo de alteración de la flora intestinal es mayor. Lo mismo ocurre si se produce excreción del antibiótico al tracto gastrointestinal, desde las glándulas salivares o con la bilis, en este caso también cuando el antibiótico se administra por vía parenteral.

En general, la administración de amoxicilina con ácido clavulánico favorece la colonización del tracto gastrointestinal por enterobacterias resistentes a la amoxicilina (2) o a la asociación y por levaduras (3). Con anterioridad se había descrito la colonización intestinal con levaduras hasta en un 50% de los pacientes tratados con esta asociación durante diez días (4). En el caso de piperacilina-tazobactam se observa una reducción de anaerobios, enterobacterias y enterococos, aunque esta alteración no se asoció al sobrecrecimiento de otros microorganismos en el estudio realizado por Nord y cols. (5). En el caso de sulbactam-ampicilina se ha observado una reducción de la microflora anaerobia y aerobia tanto en intestino como en el tracto respiratorio superior, con sobrecrecimiento de levaduras y algún bacilo gramnegativo (6, 7).

En muchas ocasiones no se aísla ningún microorganismo como causa de la diarrea. Parece que este efecto adverso tiene que ver con una disminución en la producción de ácidos grasos de cadena corta, debido a una reducción de los procesos de fermentación, con acumulación de carbohidratos, que ejercen un efecto osmótico impidiendo la absorción de agua (8).

Para que aparezca tal alteración en la flora intestinal es necesario el tratamiento con estos antibióticos durante un tiempo, al menos cuatro días. En cambio, se ha observado que en algunos casos los pacientes presentan alteraciones gastrointestinales en las primeras horas tras la administración de amoxicilina-ácido clavulánico, tanto por vía oral como parenteral. Incluso pueden aparecer de forma inmediata, durante la administración intravenosa de la asociación, que mejora al diluir más el preparado y administrarlo más lentamente.

Una posible explicación puede estar relacionada con las alteraciones de la motilidad gastrointestinal observadas tras la administración de amoxicilina-ácido clavulánico. Se estudió este efecto midiendo por manometría la motilidad en el duodeno y el yeyuno (9), observándose un incremento de la motilidad nocturna a este nivel, tanto en duración como en amplitud de las contracciones que propelen el contenido intestinal a larga distancia, conocidas como fase III dentro de la secuencia de procesos del tránsito gastrointestinal. No se conoce el mecanismo por el que esto ocurre, y tampoco se estudió este mismo efecto utilizando únicamente amoxicilina, por lo que la imputabilidad de este hecho a uno de los dos componentes de la asociación no se ha aclarado. Con anterioridad se había observado un efecto procinético con eritromicina y otros macrólidos, estimulantes de la motilidad en el estómago y el duodeno (10, 11).

Aunque la incidencia de colitis pseudomembranosa durante el curso del tratamiento con betalactámicos asociados a inhibidores de betalactamasas es muy baja, parece importante hacer un comentario al respecto, dada la gravedad del cuadro. En el caso de antibióticos administrados por vía oral, relacionados en mayor medida con el desarrollo de esta complicación, la asociación amoxicilina-ácido clavulánico se encuentra en el grupo de los fármacos implicados con mayor frecuencia, junto a la cefixima. En cualquier caso, en la población general se observan 2,3 casos de colitis pseudomembranosa por cada 100.000 prescripciones (12), aunque se ha identificado Clostridium difficile en el 13% de los niños tratados con amoxicilina-ácido clavulánico durante más de seis días, independientemente de que desarrollen diarrea o no (13).

A pesar de todo lo comentado hasta ahora, la incidencia de efectos adversos gastrointestinales no es superior a la observada durante el tratamiento con otros antibióticos, dado que existen ensayos clínicos comparativos que así lo corroboran (7, 14, 15). Estas comparaciones se han realizado entre amoxicilina-ácido clavulánico y diversos macrólidos (claritromicina, azitromicina, diritromicina) y otros betalactámicos (cefalosporinas, amoxicilina), entre piperacilina-tazobactam y carbapenémicos o la asociación clindamicina y gentamicina, y entre sulbactam-ampicilina y otros betalactámicos (cefalosporinas, aminobencilpenicilinas).

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Inhibidores de betalactamasas en el género Haemophilus

M.C. Rodríguez-Avial López-Dóriga

Servicio de Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Madrid.

Haemophilus influenzae produce importantes infecciones sistémicas, especialmente cuando presenta cápsula del serotipo b (Hib). Afortunadamente las meningitis y epiglotitis por Hib son poco frecuentes en nuestro medio. Sin embargo, sí está documentado el papel preponderante de aislamientos, fundamentalmente sin cápsula, en las infecciones respiratorias de nuestra comunidad, junto a otras especies bacterianas como Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis.

Además de por su frecuencia, H. influenzae tiene un gran interés por el constante desarrollo de resistencia a diversos tipos de antimicrobianos, entre los que se incluyen los betalactámicos. La resistencia a éstos se debe a diferentes mecanismos. El mecanismo de resistencia que aparece en primer lugar, en 1974, es la producción de una betalactamasa (1, 2), y desde entonces es la forma mas frecuente de resistencia a la ampicilina en todo el mundo (3-5). Como resultado de la búsqueda de inhibidores de betalactamasas se introduce en 1981 la asociación amoxicilina-ácido clavulánico (6), que resolvió este mecanismo de resistencia. Pero en esta misma década comienzan a publicarse aislamientos de H. influenzae resistentes a la ampicilina que no producen betalactamasas (7-10), debido fundamentalmente a una alteración en las PBP (11-14), aunque puede estar también implicada una alteración en la permeabilidad (13, 15). Estos aislamientos con resistencia intrínseca no son fáciles de detectar porque rara vez requieren mas de 4 µg/ml para su inhibición (16).

Los aislamientos con resistencia intrínseca tienen una reducción variable en su sensibilidad a otros betalactámicos; así, frente a amoxicilina-ácido clavulánico presentan una CMI dos o más de dos diluciones al doble sobre la CMI modal (16). La relevancia clínica de esta disminución, al igual que ocurre con otros betalactámicos, no está clara, pero desde un punto de vista conservador se puede asumir que todas las cepas con resistencia intrínseca son resistentes a los otros betalactámicos (17, 18).

Por otra parte, la combinación entre amoxicilina y ácido clavulánico viene ensayándose en la proporción 2:1, pero nosotros estudiamos el impacto que un eventual cambio en esta proporción tendría sobre H. influenzae, encontrando que las CMI obtenidas con las proporciones 2:1, 3:1 y 4:1 prácticamente no se alteran (19). Encontramos además tres cepas que requerían CMI de amoxicilina-ácido clavulánico de 8 µg/ml y que por tanto se deben considerar resistentes, dos de las cuales eran productoras de betalactamasas. En 1997 Doern y cols. (5), en un estudio multicéntrico en EE.UU., encuentran 17 cepas betalactamasa positivas y resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. Las posibles explicaciones de este fenotipo incluyen: hiperproducción de betalactamasas TEM-1 o ROB-1, producción de una TEM-1 o ROB-1 alterada y por ello resistente a la acción del ácido clavulánico, producción de una nueva betalactamasa resistente a la acción de este inhibidor y, finalmente, un mecanismo mixto de alteración de PBP además de producción de betalactamasa (TEM-1 o ROB-1). Esto indica que tales cepas requieren para su inhibición concentraciones superiores de todos los betalactámicos, excepto cefixima y cefpodoxima.

La segunda posibilidad mencionada en el párrafo anterior, la producción de una betalactamasa tipo TEM-1 resistente a la inhibición, es decir, un derivado de TEM-1 por mutación, que se viene denominando IRT (inhibitor resistant TEM), es un mecanismo de especial interés pues representa una adaptación específica para resistir a los inhibidores de betalactamasas. Ya han sido aisladas Escherichia coli productoras de IRT (20) y, a diferencia de las betalactamasas de espectro ampliado, están ampliamente distribuidas en las infecciones extrahospitalarias (21). ¿Cómo no se han encontrado aún en H. influenzae? Nicolas-Chanoine (22) considera que se puede deber a una mayor actividad intrínseca de las penicilinas frente a estos aislamientos o a un número inadecuado de bacterias en el reservorio humano, la nasofaringe, para que tenga lugar la mutación puntual espontánea en el gen plasmídico que codifica la betalactamasa tipo TEM.

Bibliografía

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Inhibidores de betalactamasas en Streptococcus pneumoniae

M.L. Gómez-Lus1, L. Aguilar2, M.J. Giménez2 y J. Prieto1

1Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid; 2Departamento Médico, SmithKline Beecham S.A., Madrid

tamiento de elección durante muchos años, pero desde los años 1970 han aparecido cepas con diferente grado de resistencia. La resistencia a la penicilina aparece como consecuencia de las mutaciones en los genes que codifican las PBP (proteínas fijadoras de penicilina), que producen una afinidad de fijación disminuida, alterándose las PBP1a, 2x y 2b no solamente a la penicilina sino a otros betalactámicos.

Tras producirse las mutaciones, la concentración mínima inhibitoria (CMI) se incrementa. Se define como resistencia intermedia cuando la CMI es de 0,1-1 µg/ml y la resistencia de alto grado si la CMI es ³ 2 µg/ml. En España es progresivo el aumento de cepas de S. pneumoniae multirresistentes, por lo que es importante seleccionar antimicrobianos que puedan ser eficaces en este tipo de infecciones.

Pese a que existe una afinidad reducida a otros betalactámicos y que no se ha detectado la producción de betalactamasas en S. pneumoniae, la amoxicilina y la amoxicilina-ácido clavulánico han mostrado su eficacia en el tratamiento de las infecciones respiratorias y la otitis media (1-3); además, las cepas aisladas en esputos y exudados óticos son más resistentes a la penicilina.

Según el NCCLS se consideran los siguientes valores para determinar la actividad antimicrobiana de amoxicilina-ácido clavulánico: sensible £0,5-0,25, resistencia intermedia 1-0,5, resistencia elevada ³2-1. Pese a que se consideraba que el ácido clavulánico no tenía actividad antibacteriana demostrable mediante los parámetros clásicos de valoración, Severin ha observado que se fija selectivamente a la PBP3, produciendo una lisis prematura e hipersensibilidad a la lisozima (4), así que produce alteraciones en la estructura del peptidoglicano de la pared; destaca además la reducción de la CMI de penicilina tanto en la cepa sensible como en la resistente, hecho que ya había observado años antes Greenwood (5).

Mediante curvas de letalidad bacteriana con las concentraciones alcanzadas en suero tras las dosis habituales de amoxicilina y amoxicilina-ácido clavulánico se comprobó que con concentraciones suprainhibitorias y transcurridas tres horas de incubación se produjo la misma reducción del inóculo. Es de destacar que frente a la cepa resistente el ácido clavulánico aumentó la capacidad de reducción inicial (35%), por lo que se incrementa la velocidad bactericida (6). Así, la lisis prematura producida por la unión del ácido clavulánico a la PBP produciría un aumento de la velocidad bactericida.

Por otra parte, Severin apuntaba que el ácido clavulánico hacía que S. pneumoniae fuera más vulnerable a la lisozima, y es importante recordar que los fagocitos tienen una elevada concentración de lisozima, por lo que sería importante en la función del ácido clavulánico como inmunomodulador.

En este sentido se observa un sinergismo entre el ácido clavulánico y los polimorfonucleares (PMN) frente a cepas resistentes a penicilina debido a las alteraciones que provocó el antimicrobiano sobre las bacterias, como modificaciones de la estructura de la pared bacteriana, producción de filamentación, disminución de la velocidad de crecimiento, etc. (7).

Así, al estudiar el efecto del ácido clavulánico con PMN y suero, y midiendo la muerte intra y extracelular tras una hora de incubación, se produjo una reducción del inóculo mayor del 50% a concentraciones de 1-4 µg/ml, mientras que el suero más PMN o el ácido clavulánico más suero no producen reducción del inóculo. Esto puede aparecer tras la alteración de la morfología de la pared celular que puede afectar a la fagocitosis; la muerte intrafagocítica aparecería por la acción de la lisozima, cuya función se potenciaría por la sensibilización posterior a la destrucción de la pared por el ácido clavulánico (8).

Por todo lo comentado, la asociación amoxicilina-ácido clavuánico es uno de los antimicrobianos más eficaces en el tratamiento de la otitis media y las infecciones de las vías respiratorias adquiridas en la comunidad causadas por cepas de S. pneumoniae con diferente grado de sensibilidad a la penicilina, ya que además esta asociación también es eficaz frente a otros patógenos respiratorios productores de betalactamasas, como Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis (9).

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Actividad de los inhibidores de betalactamasas frente a Acinetobacter baumannii

F. Fernández Cuenca

Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Virgen Macarena, Facultad de Medicina, Sevilla.

El mecanismo de resistencia a los betalactámicos más estudiado en Acinetobacter baumannii es la producción de betalactamasas, tanto plasmídicas como cromosómicas. Las cefalosporinas cromosómicas descritas en A. baumannii, a pesar de pertenecer al grupo 1 de la clasificación de Bush, constituyen un grupo de enzimas heterogéneo desde el punto de vista funcional. Las betalactamasas plasmídicas detectadas en A. baumannii pertenecen todas a la clase A, incluyendo TEM-1, TEM-2, CARB-5, OXA-21, ARI-1, ARI-2, AbRC-1, así como betalactamasas de espectro extendido de tipo TEM, SHV y OXA que aún no están bien caracterizadas.

El inhibidor de betalactamasas mejor estudiado en A. baumannii es el sulbactam, seguido del tazobactam, el ácido clavulánico y, en menor medida, BRL 42715.

El sulbactam es el inhibidor de betalactamasas que tiene in vitro mayor actividad intrínseca frente a A. baumannii debido a su afinidad por la PBP2 (1). De hecho, su actividad es superior a la de las penicilinas de amplio espectro y las cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación. Estudios recientes in vitro demuestran que el sulbactam solo es igual de activo (CMI50 2 mg/l) que en combinación con ampicilina, ticarcilina o ticarcilina-ácido clavulánico. Sin embargo, la CMI del sulbactam, solo o asociado con ampicilina, frente a cepas de A. baumannii multirresistentes con CMI de imipenem ³8 mg/l varía entre £4 mg/l, y ³32 mg/l (2, 3). Los resultados de los estudios realizados in vitro sobre la actividad bactericida del sulbactam son también discrepantes. Todo ello podría sugerir que en estas cepas existen mecanismos de resistencia a los betalactámicos distintos a la producción de betalactamasas (alteraciones en la permeabilidad de la membrana externa, modificaciones en las PBP, etc.).

El sulbactam inactiva principalmente las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado y en menor medida las de espectro extendido, aunque su actividad inhibidora es mucho menor que la del ácido clavulánico. Sobre las cefalosporinasas cromosómicas dicha actividad es variable, quizás debido a la heterogeneidad funcional de éstas.

El tazobactam también tiene actividad intrínseca frente a A. baumannii, pero este inhibidor de betalactamasas es menos activo que el sulbactam y, a diferencia de éste, posee mayor actividad inhibidora de betalactamasas plasmídicas. La actividad inhibidora del ácido clavulánico es similar a la del tazobactam.

El ácido clavulánico y BRL 42715, a pesar de ser muy activos frente a las betalactamasas plasmídicas, no poseen prácticamente actividad intrínseca frente a A. baumannii. BRL 42715 es, además, un potente inhibidor de betalactamasas cromosómicas. Aunque BRL 42715 posee mayor actividad inhibidora que el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam, su actividad frente a A. baumannii no está aún bien caracterizada. La asociación de BRL 42715 con ampicilina o imipenem disminuye la CMI90 16 y 64 veces, respectivamente (4).

Dentro de las combinaciones clásicas entre inhibidor de betalactamasas y betalactámico, la que presenta mayor actividad intrínseca tanto in vitro como in vivo es la asociación de ampicilina y sulbactam, debido a la actividad antibacteriana del sulbactam y a que las concentraciones de éste alcanzadas en sangre son superiores a las del ácido clavulánico y el tazobactam.

En un modelo de infección intraperitoneal por A. baumannii se ha demostrado que el sulbactam es más activo que el tazobactam (DE50 de 1,62 y 16,7 mg/kg, respectivamente), obteniéndose tasas de supervivencia del 100% con sulbactam y el 50% con tazobactam (5).

Los resultados obtenidos con la asociación de ticarcilina, ácido clavulánico y sulbactam en un modelo de neumonía murina por A. baumannii productor de cefalosporinasas (CMI de ticarcilina, imipenem y sulbactam de 32, 0,5 y 0,5 mg/l, respectivamente) sugieren la utilidad de esta combinación en el tratamiento de la neumonía por A. baumannii (6).

Algunos estudios demuestran que las asociaciones de carbapenémicos con sulbactam son muy activas in vitro, ejerciendo un elevado poder bactericida; en otros estudios, sin embargo, no se ha observado este efecto (3, 7). Otras asociaciones que han mostrado tener efecto bactericida in vitro son sulbactam más ceftazidima, cefepima o cefpiroma (3).

La experiencia clínica con inhibidores de betalactamasas en el tratamiento de las infecciones por A. baumannii es limitada. No obstante, la asociación más utilizada ha sido ampicilina (2 g) más sulbactam (1 g), con la que se han obtenido tasas de curación que oscilan entre el 50% y el 75% (2, 8).

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Betalactámicos-inhibidores de betalactamasas en Mycobacterium

J.C. Galán

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

Epidemiología

Desde 1953 a 1985 el número de casos de tuberculosis comunicados disminuyó con un promedio anual del 5,8%. Sin embargo, esta tendencia se invierte en 1985, con un incremento del 20% por cada 100.000 habitantes. En un periodo muy corto las cifras se convierten en alarmantes. Simultáneamente, la aparición de cepas resistentes es cada vez más frecuente y se describen dramáticamente los primeros brotes de tuberculosis multirresistente (con una mortalidad próxima al 70%), lo que supone recurrir a fármacos de segunda línea, que por su toxicidad habían sido excluidos (capreomicina, tiacetazona). Esta situación hace que en 1993 la OMS declare, en una actuación sin precedentes, a la tuberculosis como una emergencia sanitaria mundial.

Se ensayan otros regímenes terapéuticos, como las nuevas fluoroquinolonas (ofloxacino y las más modernas como moxifloxacino y esparfloxacino), ésteres y derivados de la pirazinamida, derivados imidazólicos y antibióticos betalactámicos, entre otros.

La idea de emplear betalactámicos para el tratamiento de la tuberculosis se ha visto siempre como poco acertada. La experiencia clínica esta repleta de ejemplos de pacientes que recibieron betalactámicos para el tratamiento de una supuesta neumonía bacteriana, cuya situación no mejoró y posteriormente se demostró que tenían tuberculosis. Sin embargo, algunas notas pueden sugerirnos que los antibióticos betalactámicos pueden formar parte de los regímenes antituberculosos:

1) El grado de penetración de los antibióticos betalactámicos a través de la membrana celular de las micobacterias es baja (comparado con el de Escherichia coli), y el equilibrio a ambos lados de la membrana tarda unos minutos en alcanzarse, pero como el tiempo de generación para Mycobacterium tuberculosis es de 18 a 24 horas, es suficiente para alcanzar concentraciones inhibitorias.

2) Desde el punto de vista bioquímico los betalactámicos presentan afinidad por las PBP de las micobacterias a unas concentraciones que son alcanzables con las dosis terapéuticas habituales.

Betalactámicos En Tuberculosis

Antecedentes

Los antibióticos betalactámicos resultan ineficaces para el tratamiento de la tuberculosis y de casi todas las micobacteriosis, con CMI >128 µg/ml.

En 1966, Kasik trata con bencilpenicilina, bencilpenicilina más dicloxacilina y suero fisiológico a ratones con tuberculosis. La vida media de los animales control fue de 30 días, incrementándose en los tratados con bencilpenicilina más dicloxacilina. En 1987-1988 Casal, Sorg y Wong demuestran que la administración conjunta de un betalactámico y un inhibidor de betalactamasas reduce la CMI más de ocho veces. Estos resultados han sido repetidos por otros muchos investigadores en años sucesivos: Zhang en 1992, Chambers en 1995 o Segura en 1998, entre otros. En todos los casos el ácido clavulánico resulta ser el más potente inhibidor.

Resistencias A Los betaLactámicos En Micobactrerias

La resistencia a los antibióticos betalactámicos en micobacterias, como en la mayoría de las bacterias, depende de uno o más de estos factores:.

– Impermeabilidad: en M. chelonae, la baja permeabilidad (10 veces menor que en M. tuberculosis e igual que en Pseudomonas aeruginosa) a los betalactámicos parece ser el factor crítico en la resistencia.

– Alteración de las PBP: M. smegmatis presenta resistencia por disminución de la afinidad por la PBP1. Mutantes en M. fortuitum tratado con cefoxitina presentan disminución de afinidad en todas las PBP.

– Presencia de betalactamasas: en M. fortuitum, M. tuberculosis y M. smegmatis se han descrito betalactamasas. M. gastri y M. kansasii hidrolizan la nitrocefina, pero no se ha identificado ninguna betalactamasa.

Betalactamasas en M. tuberculosis

Existe cierta controversia en determinar las betalactamasas que tiene M. tuberculosis (si es que tiene más de una). Existe una betalactamasa identificada por Chambers en 1997, denominada BlaA, con actividad predominantemente penicilinasa.

La disponibilidad de la secuencia del genoma de M. tuberculosis ha permitido encontrar ORF que muestran alguna homología con betalactamasas de clase A y de clase C. Además, existen evidencias indirectas de su existencia: Kishan comunica la detección de una enzima con actividad cefalosporinasa, con pI 4,5, que presenta un perfil de sustrato distinto a la betalactamasa principal, BlaA; Chambers encuentra hibridación positiva con una sonda de ampC sobre DNA total de M. tuberculosis.

Estudios con BlaA de M. Tuberculosis

En 1997 el grupo de Chambers clonó y secuenció la única betalactamasa descrita hasta la fecha. Se trata de una betalactamasa de clase A, perteneciente al grupo 2b (betalactamasas inhibibles por ácido clavulánico), de acuerdo con la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros.

Es una penicilinasa con pI 4,9-5,1, causante de más del 80% de la actividad betalactamasa. Es una exoenzima de expresión constitutiva, pues su producción no es inducible en presencia de betalactámicos ni se ha descrito ningun regulador similar a los que aparecen en betalactamasas homólogas (como BlaR en B. liqueniformis).

Presenta los cuatro dominios propios de betalactamasas de clase A, con la peculiaridad del motivo SDG, sólo descrito previamente en la betalactamasa de S. clavuligerus.

No confiere resistencia cuando se transforma en E. coli.

Actividad De Los Inhibidores De Betalactamasasen En Pacientes Con Tuberculosis

Hasta ahora, los pocos casos de pacientes tratados con amoxicilina-ácido clavulánico (2:1) eran simultáneamente tratados con otros fármacos antituberculosos, lo que hacía difícilmente valorable el efecto del betalactámico más el inhibidor de betalactamasas. Chambers realiza el primer estudio en pacientes con tuberculosis tratados en monoterapia con amoxicilina-ácido clavulánico durante siete días, observando una reducción de cinco veces en el número de bacilos viables, pero toda la reducción ocurre en los tres primeros días de tratamiento; es lo que él denomina "efecto plateau". Es la primera vez que los betalactámicos han demostrado ser útiles frente a la tuberculosis en un ensayo clínico, resultando por ello de especial interés conocer los mecanismos de resistencia a la asociación de betalactámico más inhibidor de betalactamasas.

Si la betalactamasa resulta ser el mecanismo fundamental de la resistencia a los betalactámicos en M. tuberculosis, será de gran utilidad la identificación y caracterización de mutaciones implicadas en la resistencia a los inhibidores, cuyo conocimiento nos permitirá desarrollar nuevas moléculas activas frente a esos mutantes.

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