1998 Estrategias de inhibición de mecanismos de resistencia



Inhibición de mecanismos de permeabilidad y bombeo .

J.L. Martínez

Centro Nacional de Biotecnología (CSIC), Campus UAM, Cantoblanco, Madrid.

Uno de los mayores problemas para el tratamiento de las infecciones debidas a ciertas familias de bacterias es su baja sensibilidad intrínseca a distintos antibióticos. Esto es particularmente grave en el caso de patógenos oportunistas como Pseudomonas y otros géneros bacterianos filogenéticamente cercanos y que dan cuenta de un porcentaje elevado de las infecciones hospitalarias. El punto de vista tradicional indicaba que el motivo por el cual estas bacterias eran poco sensibles a los antibióticos era su baja permeabilidad a distintos compuestos (1).

Sin embargo, más recientementemente se ha visto que la explicación no es tan sencilla. A finales de los años 1980 se describió por vez primera la existencia de sistemas capaces de expulsar de un modo activo a los antibióticos hacia el exterior de las bacterias, y desde mediados de la presente década se ha venido caracterizando un número cada vez mayor de dichos sistemas. Los sistemas de bombeo de antibióticos en las bacterias gramnegativas constan de tres proteínas: una presente en la membrana citoplásmica, otra en la membrana externa y otra que actúa como unión entre ambas. El sistema está acoplado, para su funcionamiento, al potencial de membrana. En el caso de las bacterias grampositivas el sistema es más sencillo, con una única proteína implicada en el transporte de fármacos, cuya actividad es dependiente de ATP. Es de notar que estos sistemas de transporte son muy homólogos, tanto estructural como funcionalmente, a sistemas de transporte de fármacos implicados en la resistencia a agentes anticancerígenos. Otro aspecto importante de los sistemas de bombeo de antibióticos es que tienen un rango de sustrato muy amplio, recibiendo en consecuencia el nombre de Multi-Drug-Resistance systems (MDR) (2).

En cuanto a su distribución, hay sistemas que sólo están presentes en algunas cepas de una especie bacteriana, pero la gran mayoría se encuentran en el genoma de todos los individuos pertenecientes a dicha especie (3). En nuestro laboratorio hemos demostrado que los tres sistemas de bombeo descritos hasta el momento en P. aeruginosa están presentes tanto en cepas de origen clínico como de origen medioambiental (datos no publicados). Asimismo, hemos demostrado la existencia de sistemas MDR, inducibles por metales pesados, en enterobacterias de origen medioambiental (4). Esto da idea de que los sistemas de bombeo son ubicuos y, de hecho, el análisis de secuencias completas de microorganismos indica su presencia en los cromosomas de todas las bacterias caracterizadas. La única diferencia entre cepas resistentes y sensibles consiste en que, en las primeras, el sistema MDR se expresa de modo constitutivo como consecuencia de mutaciones en sus elementos reguladores. Por otra parte, a pesar de que los sistemas MDR no se expresan en condiciones habituales de cultivo en el laboratorio, cabe destacar que han de tener una función in vivo. Su expresión ha de ser inducible bajo ciertas condiciones, y esto puede producir fenómenos de resistencia fenotípica en el punto de la infección, no detectables mediante técnicas rutinarias de análisis en el laboratorio (5).

El hecho de que los sistemas MDR sean ubicuos e intervengan en el bombeo de numerosos antibióticos los convierte en blancos ideales para la búsqueda de nuevos inhibidores bacterianos, capaces de hacer a las bacterias que portan estos sistemas más sensibles a los antibióticos actualmente existentes en el repertorio clínico. Se ha determinado también que mutantes de Escherichia coli y P. aeruginosa en los cuales se han inactivado sistemas MDR se hacen más sensibles a distintos antibióticos. Estos datos indican que los inhibidores de sistemas MDR pueden tener interés terapéutico, y no sólo para el tratamiento de la infeccion, sino para evitar la emergencia de mutantes resistentes que requieran una doble mutación para producir su fenotipo. En este sentido se ha descrito que el tratamiento con reserpina, un inhibidor de los sistemas de bombeo de bacterias grampositivas, disminuye la frecuencia de emergencia de mutantes resistentes a las quinolonas en dichas bacterias (6). Por otra parte, se ha visto que en la mayor parte de los aislamientos clínicos la resistencia a las quinolonas está asociada a la presencia de mutaciones en topoisomerasas conjuntamente con una sobreexpresión de sistemas MDR, lo cual indica que probablemente son necesarias ambas mutaciones para dar lugar a una resistencia de relevancia clínica (7).

A pesar del interés que pueden tener, no existen todavía inhibidores de sistemas de bombeo con aplicación terapéutica, aunque hay compañías farmacéuticas que están trabajando de modo muy activo para conseguirlos. Los futuros inhibidores podrían ser de tres clases:

a) Inhibidores de la fuente de energía requerida para el funcionamiento de los sistemas MDR: inhibidores del potencial de membrana (CCCP) o de la actividad ATPasa (reserpina) que se utilizan en el laboratorio en la actualidad para caracterizar los sistemas MDR, pero su alta toxicidad hace que no sean adecuados para uso terapéutico.

b) Inhibidores directos de las bombas: moléculas que interaccionarían con las bombas inactivándolas irreversiblemente de un modo semejante a los inhibidores de betalactamasas. En nuestro grupo hemos obtenido anticuerpos específicos contra un sistema de bombeo de Stenotrophomonas maltophilia y su uso permite disminuir los valores de CMI de distintos antibióticos.

c) Inhibidores de los sistemas reguladores de la expresión de las bombas. La expresión de los sistemas MDR tiene una regulación compleja que se conoce poco. Se sabe, por ejemplo, que en algunos casos su expresión se activa por salicilato. La utilización de análogos estructurales capaces de unirse al activador, pero impidiendo que actúe como tal, podrían ser de utilidad para la inhibición de los sistemas MDR.

Como resumen cabe destacar que el desarrollo de inhibidores de MDR prodría contribuir de modo muy significativo a mejorar la actividad de los antibióticos que se utilizan en la actualidad. Dado que los sistemas MDR tienen una funcionalidad, que no conocemos, distinta de la resistencia a antibióticos, estos inhibidores incluso podrían tener una actividad antibacteriana directa.

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Mecanismos de inhibición debetalactamasas.

M.J. Fresnadillo

Departamento de Microbiología, Hospital Universitario, Salamanca.

La producción de betalactamasas constituye el principal mecanismo de resistencia a los antibióticos betalactámicos, fundamentalmente en gramnegativos, y ha motivado que gran parte de los esfuerzos, en el ámbito de estos antimicrobianos, se haya centrado en el diseño de estrategias encaminadas a neutralizar y contrarrestar su acción. Las desarrolladas hasta la actualidad incluyen la síntesis de análogos estables a la degradación enzimática, el desarrollo de preparados con poca afinidad por las betalactamasas, el empleo de sustancias bloqueantes y la utilización de inhibidores de betalactamasas en combinación con "auténticos antimicrobianos", a los que protegen de la inactivación enzimática.

Las primeras aproximaciones en la lucha contra las betalactamasas se realizaron durante los años 1940 y 1950, e incluyeron el empleo de un suero antibetalactamasa (1) y de diversos compuestos orgánicos (laurilsulfato, benzoato y sulfanilato sódicos, xilocaína, 2 bencilimidazol, etc.), pero los resultados fueron desalentadores (2) (incluso, en el caso del suero antibetalactamasa, se produce una activación de determinadas enzimas) (3) y no se logró encontrar ningún agente clínicamente utilizable. El descubrimiento de la cefalosporina C (4) y de las primeras penicilinas semisintéticas (meticilina, nafcilina e isoxazolpenicilinas) marca el verdadero comienzo del desarrollo de los inhibidores de betalactamasas, ya que se muestran estables a la hidrólisis y actúan como inhibidores competitivos al asociarse a un betalactámico lábil. Sin embargo, esta estrategia carece de utilidad práctica porque las penicilinas antiestafilocócicas atraviesan con gran dificultad la pared de los bacilos gramnegativos y por tanto no llegan al espacio periplásmico, donde se encuentran las enzimas. A pesar de este "fracaso", los resultados obtenidos animaron a diversos grupos de investigadores a dirigir sus esfuerzos a la búsqueda de moléculas con capacidad inhibitoria frente a las betalactamasas. Así, en 1967 se inicia en los Laboratorios Beecham un programa de investigación encaminado a detectar metabolitos microbianos con actividad inhibitoria de betalactamasas, que tuvo como consecuencia el descubrimiento de los ácidos olivánicos a partir de una cepa de Streptomyces olivaceus (5) y del ácido clavulánico producido por Streptomyces clavuligerus (cepa ATCC 27064) (6). El ácido clavulánico muestra escasa actividad antimicrobiana pero una importante capacidad de inhibir algunas betalactamasas, por lo que se convirtió en el prototipo de molécula con dicha función y "validó" la eficacia de esta estrategia.

Con posterioridad se descubrieron otros inhibidores: en 1978 el sulbactam (Barth en laboratorios Pfizer), en 1980 la sultamicilina (Bigham) (un doble éster o profármaco mutuo de sulbactam y ampicilina) y en 1984 el tazobactam (Micetich para laboratorios Taiho). Los derivados halogenados del ácido penicilánico, ácidos 6b-bromo (brobactam) y 6ß-iodo penicilánico también son buenos inhibidores de betalactamasas, comparables al ácido clavulánico, aunque aún no se han introducido en clínica. El ácido 6b-cloro penicilánico posee menor capacidad de inhibición. Sin embargo, la diana prioritaria de todas estas moléculas son las betalactamasas de la clase A, por lo que la investigación continúa, fundamentalmente encaminada hacia la búsqueda de moléculas con actividad frente a las clases B y C. Así, los últimos compuestos estudiados, todos con estructura betalactámica y pertenecientes a diferentes grupos [carbacefémicos (RO 485545, RO488724, RO 488391), sulfonas del ácido penicilánico (SYN 1849, SYN 1852, SYN 1903, RO 481220, RO 481256, CL 186190, GD 40), derivados halogenados (GD 40), monobactámicos (RO 481256, EP 508234, JP 93186468, SYN 2190), etc.] muestran una capacidad inhibitoria frente a las betalactamasas plasmídicas y cromosómicas de la clase C mayor que la del ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam, y se han descrito compuestos (LL10G568a, LL10G568b, diferentes derivados del ácido mercaptoacético) que inhiben metaloenzimas hidrolizantes de carbapenémicos y cefamicinas (betalactamasas de la clase B) (7-10).

Las moléculas que actúan como inhibidores de betalactamasas pueden hacerlo según un mecanismo competitivo, si el inhibidor y el sustrato (betalactámico sensible a betalactamasas) compiten por el lugar activo de la enzima, o no competitivo. La inhibición competitiva tiene lugar con moléculas que poseen estructura química betalactámica. Puede producirse por dos mecanismos fundamentales: formación de complejos enzima-sustrato sin o con interacciones químicas (reversible e irreversible) y "bloqueo " por sustratos "pobres" o "perezosos" que son degradados muy lentamente (sustratos competitivos). Se comportan de esta forma las penicilinas antiestafilocócicas (meticilina, nafcilina e isoxazolpenicilinas), la temocilina, las cefamicinas, el aztreonam, los carbapenémicos, etc. (10).

A su vez, la inhibición puede ser reversible si la enzima recupera su acción después de desligarse del inhibidor (isoxazolpenicilinas) e irreversible si la enzima permanece inactiva incluso después de liberarse del inhibidor, debido a que se produce una alteración química y conformacional de la enzima. A este último grupo pertenecen diversas sustancias que reaccionan covalentemente con aminoácidos de la enzima, inhibidores dirigidos al grupo activo de la enzima y un grupo conocido como inhibidores "suicidas" porque en el proceso se autodestruyen. El ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam se comportan eminentemente como inhibidores suicidas, aunque sus características cinéticas pueden verse modificadas dependiendo de la enzima. El tipo de inhibición que producen es, a su vez, competitiva por motivos estructurales, selectiva y progresiva en función del tiempo y de la concentración de inhibidor (11).

El primer paso de la reacción entre betalactamasa e inhibidor suicida es el posicionamiento de la molécula del inhibidor en el centro activo de la enzima. El inhibidor y el grupo catalítico no sólo deben estar próximos sino también alineados convenientemente, de modo que pueda formarse un complejo previo a la acilación. Las uniones son débiles y se establecen mediante puentes de hidrógeno y uniones electrostáticas, por lo que este complejo tiene carácter reversible. El ataque nucleofílico del grupo carbonil del inhibidor por el OH de la serina 70 en conjunción con los radicales activos del glutámico 166, la lisina 73, la serina 130 y la lisina 234 (en las betalactamasas del grupo A) y la posterior rotura del anillo no betalactámico dan lugar a la formación de un complejo covalente acil-enzima, a varios compuestos de transición y a compuestos lineales, sin actividad enzimática e irreversibles debido a la ausencia de un paso de desacilación, existente en el ataque a sustratos sensibles, necesario para la regeneración de la enzima (12-14).

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Mecanismos de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas.

J. Blázquez

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

La hidrólisis enzimática, las mutaciones en las dianas (PBP), las bombas de flujo y las mutaciones que impiden o reducen la entrada del antibiótico constituyen los principales mecanismos de resistencia a los antibióticos betalactámicos en las bacterias patógenas. A pesar de la diversidad de mecanismos, el más común es la presencia de enzimas capaces de hidrolizar el anillo betalactámico, las betalactamasas, y convertir a estos antibióticos en inactivos. Durante años se ha tratado de evitar la resistencia a los betalactámicos mediante el desarrollo de nuevas moléculas, ya sean resistentes a la hidrólisis (como las cefalosporinas de tercera generación) ya sean inhibidoras de la actividad hidrolítica (como el ácido clavulánico). La evolución y diseminación de las betalactamasas parece ser consecuencia de la evolución y el consumo de antibióticos betalactámicos. La gran cantidad de variantes de betalactamasas que existe da idea de la enorme presión selectiva a que han sido sometidas. Se conocen, por ejemplo, más de 60 variantes de betalactamasas de tipo TEM, fruto solamente de entre uno y cinco cambios en las secuencias de TEM-1 o TEM-2 (1, 2). Con estos pocos cambios, las betalactamasas de tipo TEM son capaces de ampliar su espectro de sustratos (betalactamasas de espectro ampliado, BLEA), hidrolizando las nuevas moléculas desarrolladas precisamente para evitar dicha hidrólisis.

Como en el caso de las cefalosporinas de tercera generación, las bacterias patógenas han respondido al desarrollo y uso de los inhibidores de betalactamasas. La resistencia a los inhibidores de betalactamasas en patógenos productores de este tipo de enzimas se debe principalmente a dos mecanismos: betalactamasas variantes con sensibilidad disminuida (3) o hiperproducción de la enzima (4). Además, estos dos mecanismos pueden aparecer unidos a otros, como una disminución de la entrada del inhibidor y la presencia de bombas de flujo. De forma similar a las BLEA, uno o varios cambios en determinadas posiciones de estas enzimas las convierten en más resistentes a la acción de los inhibidores. Hasta hace muy poco, la resistencia a las nuevas cefalosporinas y la resistencia a los inhibidores se encontraba segregada en este tipo de enzimas. Incluso, y debido a los resultados obtenidos en el laboratorio con genes híbridos, se pensó en la imposibilidad de la coexistencia de los dos tipos de mutaciones en la misma molécula de proteína. Desgraciadamente ya se ha descrito la primera betalactamasa de tipo TEM con actividad aumentada contra las cefalosporinas de tercera generación y sensibilidad disminuida a los inhibidores de betalactamasas (5). La experiencia de los últimos años nos demuestra que, debido a la gran capacidad de variación y adaptación que poseen los microorganismos, es muy posible que estas betalactamasas mutantes se encuentren con frecuencia en un futuro y que además sean cada vez más eficaces.

El mundo microbiano ha sabido responder a cada una de las estrategias empleadas para luchar contra la producción de betalactamasas. Sin embargo, a pesar del desarrollo de un enorme número de variantes enzimáticas, las bacterias poseen aún otro recurso: las betalactamasas de clase C. Estas enzimas, codificadas en el cromosoma de muchos gramnegativos y de la mayor parte de las enterobacterias, poseen la capacidad de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación y son, además, naturalmente resistentes a la inhibición por los inhibidores clásicos. Además, la producción de la mayoría de estas enzimas es inducible indirectamente por la acción de los betalactámicos, e incluso por los inhibidores de betalactamasas. El ácido clavulánico, por ejemplo, ejerce una acción paradójica sobre la producción de la enzima AmpC en algunos gramnegativos como Enterobacter cloacae: a pesar de inhibir sólo débilmente la actividad de AmpC, es capaz de inducir la transcripción del gen (AmpC) que codifica para la betalactamasa cromosómica. La creciente aparición de aislamientos clínicos portadores de betalactamasas de tipo AmpC codificadas en plásmidos (6), y por lo tanto transmisibles entre diferentes cepas, junto con el aislamiento de las primeras variantes naturales de AmpC con actividad incrementada contra cefalosporinas (7, 8), complica todavía más el panorama para los antibióticos betalactámicos y los inhibidores de betalactamasas. Además, se ha demostrado que no se puede descartar la aparición de variantes de AmpC capaces de conferir resistencia a las cefalosporinas de cuarta generación (9). Se hace necesario, por lo tanto, el desarrollo de nuevas moléculas inhibidoras que actúen sobre las betalactamasas de tipo AmpC. Para ser completamente eficaces, estas nuevas moléculas no deberían ser afectadas por los mecanismos habituales de resistencia a los inhibidores betalactámicos, como mutaciones en porinas, bombas de flujo y adquisición de mutaciones enzimáticas que disminuyan la afinidad por la molécula. Según esto, parece adecuado el estudio y desarrollo de inhibidores no betalactámicos de betalactamasas de tipo AmpC (10).

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Farmacodinamia y actividad no enzimática de los inhibidores de betalactamasas

L. Aguilar1, M.J. Giménez1 y M. Gómez-Lus2

1Departamento Médico, SmithKline Beecham, S.A., Madrid; 2Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid.

El objetivo de la farmacodinamia como disciplina es estudiar las interacciones de fármaco y diana (1). En el caso de los inhibidores de betalactamasas, como su propio nombre indica, la diana de actuación es dicha enzima bacteriana. Sin embargo, para completar el estudio de la acción de estos compuestos, entre los que cabe destacar al ácido clavulánico, como estrategia de inhibición de los mecanismos de resistencia bacterianos, parece necesario explorar su acción sobre la diana celular, a pesar de su nulo efecto antibacteriano clásico propio (2), así como el efecto sobre la acción de los fagocitos polimorfonucleares como primera línea de defensa antibacteriana.

Desde un punto de vista farmacodinámico se ha investigado la acción antienzimática del ácido clavulánico (efecto de concentraciones variables que simulan las concentraciones séricas obtenidas a lo largo del intervalo de dosificación) sobre la actividad betalactamasa bacteriana considerando tres aspectos:

1) Decremento de la actividad betalactamasa a lo largo del tiempo. Este decremento se obtuvo con ácido clavulánico, a pesar del mantenimiento de la viabilidad bacteriana, en experimentos realizados con Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus (3).

2) Efecto postbetalactamasa (definido como decremento de la actividad betalactamasa con respecto a un control tras la desaparición del inhibidor del medio). El ácido clavulánico ha demostrado presentar un efecto postbetalactamasa superior a cuatro horas para H. influenzae y S. aureus (3).

3) Mantenimiento del efecto postantibiótico por el efecto postbetalactamasa (anteriormente definido) y la presencia de concentraciones subinhibitorias del antibiótico, traduciéndose en un mantenimiento del decremento de la viabilidad bacteriana a lo largo del tiempo (S. aureus sensible y resistente a meticilina) (4, 5).

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico sobre la diana celular que han sido detenninadas son:

1) Retraso con respecto al control en el tiempo de generación de S. aureus (4) y Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina (6).

2) Aumento del enlentecimiento del crecimiento de S. pneumoniae producido por concentraciones subinhibitorias de amoxicilina (7).

3) Incremento de la velocidad y la magnitud de la actividad bactericida de la amoxicilina frente a S. pneumoniae resistente a penicilina (7).

4) Aumento de la velocidad de acción bactericida de la amoxicilina sobre la subpoblación resistente de S. aureus heterorresistente (5).

5) Disminución de la CMI de amoxicilina en cepas de H. influenzae no productor de betalactamasa que presentan elevada CMI (8).

Por último, el efecto del ácido clavulánico sobre la acción de los polimorfonucleares en una cepa de S. pneumoniae resistente a penicilina, en presencia de suero humano no inactivado, ha sido estudiada con respecto a:

1) Decremento del inóculo inicial de S. pneumoniae resistente a penicilina en presencia de polimorfonucluares, suero humano y concentraciones fisiológicas de ácido clavulánico (6).

2) Decremento de la viabilidad bacteriana de S. pneumoniae resistente a penicilina por concentraciones subinhibitorias de amoxicilina-ácido clavulánico en presencia de polimorfonucleares y suero humano (7).

3) Consecución de actividad bactericida (definida como una reducción >99% del inóculo inicial) frente a S. pneumoniae resistente a penicilina por parte de concentraciones fisiológicas de amoxicilina-ácido clavulánico tras una hora de incubación en presencia de polimorfonucleares y suero humano (7).

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico sobre S. pneumoniae se basan en la acción de éste sobre la PBP3 (diana no lítica) (9), desestructurando la pared y favoreciendo la actuación de la amoxicilina, la opsonofagocitosis y la muerte intracelular por lisozima (10)..

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico en presencia o ausencia de factores defensivos del huésped podrían explicar el recientemente descrito (11) aumento de la actividad in vivo frente a S. pneumoniae de amoxicilina-ácido clavulánico en comparación con amoxicilina.

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  6. Gómez-Lus, M.L., Aguilar, L., Martín, M., Giménez, M.J., Martínez, P., Prieto, J. Intracellular and extracellular killing of a penicillin-resistant, serotype-9 strain of Streptococcus pneumoniae by polymorphonuclear leukocytes in the presence of sub-inhibitory concentrations of clavulanic acid. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 142-144.
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  8. Aguilar, L., Perea, E., García de Lomas, J., Granizo, J.J. Does clavulanic acid decrease amoxicillin MIC for ß-lactamase negative Haemophilus influenzae strains? En: Second International Meeting on the Therapy of Infections, Florencia 1998; Abstract no. A10, pg. 107.
  9. Severin, A., Severina, E., Tomasz, A. Abnormal physiological properties and altered cell wall composition in Streptococcus pneumoniae grown in the presence of clavulanic acid. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 504-510.
  10. Prieto, J., Frías, J., Alou, L., Carcas, A. Estudio de la actividad bactericida de la combinación amoxicilina/ácido clavulánico y sus posibles efectos ante la resistencia a betalactámicos de Streptococcus pneumoniae. Med Clin (Barc.) 1998; 110 (Supl. 1): 12-15.
  11. Smith, G.M., Slocombe, B., Abbott, K.H., Mizen, L.W. Activity of amoxicillin-clavulanate against penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae in an experimental respiratory infection model in rats. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 813-817.

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Problemas de la detección de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasasen el laboratorio

F.J. Castillo García

Servicio de Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Zaragoza.

Aunque hay varios mecanismos bioquímicos que pueden explicar la resistencia a los betalactámicos en los bacilos gramnegativos, la biosíntesis de betalactamasas es el más importante. Para superar este problema una de las estrategias más eficaces consiste en la combinación de betalactámicos con inhibidores suicidas de betalactamasas. Así disponemos en la clínica de diferentes inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam) que son particularmente activos frente a las betalactamasas plasmídicas.

La resistencia a la asociación de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas fue descrita por primera vez en nuestro país en 1987 (5). Circunscrita inicialmente a Escherichia coli, se ha observado más recientemente en algunas cepas de Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri y Haemophilus influenzae (7, 12). En E. coli, especie en la que sin duda la resistencia ha alcanzado una mayor difusión, se han descrito varios mecanismos causantes de la disminución de sensibilidad a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas:.

1) Hiperproducción de betalactamasa cromosómica del grupo 1, que es menos sensible que las enzimas del grupo 2 a la acción de los inhibidores de betalactamasas. En algunas cepas la producción de esta betalactamasa está constitutivamente desreprimida por mutaciones en AmpC o por la adquisición de un promotor más fuerte (13). La existencia de cepas que han adquirido la capacidad de producir AmpC vía plásmidos a partir del cromosoma de otras bacterias, tales como Citrobacter sp. o Enterobacter sp., puede expandir en el futuro este mecanismo de resistencia.

2) Algunas betalactamasas plasmídicas, como OXA-1, son menos sensibles que las betalactamasas tipo TEM a la inhibición por inhibidores de betalactamasas, de modo que las cepas que producen estas enzimas son con más frecuencia resistentes a las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas (15).

3) La hiperproducción de betalactamasas plasmídicas de amplio espectro del grupo 2b no modificadas (TEM-1, TEM-2, SHV-1) es un mecanismo muy frecuente de resistencia, que puede deberse a la presencia de plásmidos multicopia o a la existencia de un promotor más potente (8, 10).

4) La modificación en las proteínas de membrana externa OmpF y/o OmpC, que limitan la penetración de las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas, en conjunción con la producción de betalactamasas también confieren resistencia (10).

5) Desde que se identificaron por primera vez en 1989, en Francia y en España (1, 2), se han descrito numerosas mutantes de TEM-1 o TEM-2 (TEM-30 a TEM-41, TEM-44, TEM-45) con modificaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de la enzima que se traducen en una sensibilidad sustancialmente reducida frente a los inhibidores de betalactamasas. Solo hay un informe de un aislamiento clínico en Grecia que posea una IRBL derivada de SHV, la SHV-10 (9). Pertenecen al grupo 2br y se las conoce con el nombre de IRT (inhibitor resistant TEM) o IRBL (inhibitor resistant TEM betalactamases).

Mientras que los mecanismos de resistencia de las otras categorías se encuentran prácticamente circunscritos a E. coli, el potencial de difusión epidémica inherente a un mecanismo de codificación plasmídica, como es la síntesis de IRBL, representa un peligro considerablemente mayor para la actividad de las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas.

Estudios epidemiológicos llevados a cabo en diferentes países europeos han evidenciado que la frecuencia de cada mecanismo de resistencia varía de unas zonas a otras, lo que podría estar en relación con el diferente uso que se hace de los antibióticos betalactámicos en los distintos países (12). La vigilancia en el laboratorio de microbiología clínica del estado de la resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas y el conocimiento de los mecanismos involucrados son fundamentales para garantizar la eficacia clínica e influir en el uso de los diferentes antibióticos betalactámicos en la comunidad y en el medio hospitalario. Ahora bien, para conseguir este objetivo existen algunas dificultades, como la variabilidad en los resultados consecuencia de las diferencias existentes en la metodología utilizada por los distintos laboratorios. Este problema adquiere más importancia si consideramos la relativa frecuencia con que las cepas presentan una disminución de sensibilidad más que valores de CMI pertenecientes a la categoría de resistentes, lo que puede llevar a subestimar la importancia real del problema (13).

La metodología usada para probar la sensibilidad bacteriana a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y en particular a amoxicilina-ácido clavulánico, no está universalmente homologada. Ello lleva a probar este compuesto tanto con una concentración fija de ácido clavulánico (2 µg/ml) como manteniendo una proporción 2:1 entre la amoxicilina y el ácido clavulánico. Cuando se prueban las mismas cepas en las mismas condiciones los resultados varían notablemente según se use la concentración fija o la proporcional del inhibidor. Así, con la relación 2:1 siempre se obtiene mayor porcentaje de cepas sensibles (14). Por tanto, este método puede subestimar el índice global de resistencia y, eventualmente, inducir algún fracaso terapéutico. Si queremos vigilar eficientemente la aparición de cepas portadoras de IRBL, conviene no olvidar que su detección es más probable si se usa una concentración fija de inhibidor en las pruebas de sensibilidad (14).

La lectura interpretativa del fenotipo de resistencia constituye un método universalmente asequible y puede resultar muy útil, al menos para hacer una selección preliminar de las cepas que nos ayude a sospechar el mecanismo de resistencia involucrado y a elegir el método de confirmación que sea necesario.

Cuando la resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas se debe a la sobreproducción de la cefalosporinasa cromosómica del grupo 1, el patrón de resistencia incluye aminopenicilinas, amoxicilina-ácido clavulánico, cefalosporinas de primera y segunda generación y cefamicinas. Se elevan discretamente las CMI de las carboxipenicilinas y ureidopenicilinas, y pueden encontrarse cepas con sensibilidad disminuida a todos los betalactámicos excepto los carbapenémicos (11). La cloxacilinasa OXA-1 no es tan bien inhibida como la TEM-1 por los diferentes inhibidores de betalactamasas. La hiperproducción de esta enzima, además de elevar la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico, disminuye la sensibilidad a la cefpiroma (2-8 µg/ml) y a la cefotaxima (0,5-2 µg/ml), sin afectar a la ceftazidima ni al aztreonam (6). Se puede sospechar su presencia en cepas resistentes a aminopenicilinas, carboxipenicilinas y asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y en sensibles a cefalotina (15). El fenotipo de las cepas hiperproductoras de betalactamasas del grupo 2b incluye CMI muy elevadas para aminopenicilinas, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas y en menor grado para la amoxicilina-ácido clavulánico y las cefalosporinas de primera y segunda generación.

Puede producirse también un ligero aumento de las CMI de ceftazidima y aztreonam (6).

Las cepas productoras de IRBL son resistentes a las penicilinas de amplio espectro, solas y en combinación con inhibidores de betalactamasas. Se mantienen sensibles a las cefalosporinas de primera y segunda generación y a las cefamicinas. La resistencia a amoxicilina-ácido clavulánico, junto con la sensibilidad completa a la cefazolina y la cefoxitina, sugieren la presencia de un mecanismo enzimático de resistencia diferente de la hiperproducción de TEM o de las alteraciones de la membrana (2, 3).

La determinación del punto isoeléctrico (pI) mediante isoelectroenfoque analítico es de gran ayuda para confirmar la interpretación fenotípica. Así, las betalactamasas TEM-1, TEM-2 y OXA-1 tienen pI de 5,4, 5,6 y 7,4, respectivamente. Las IRBL tienen pI de 5,4 o 5,2 y las cepas hiperproductoras de betalactamasa cromosómica tienen pI superiores a 8 (3, 4, 13).

Más complicada y laboriosa resulta la determinación de los parámetros cinéticos de las diferentes betalactamasas, así como la secuenciación y la oligotipificación de los genes que codifican la betalactamasa, que resulta obligada para definir las sustituciones en la secuencia de los aminoácidos y con ello la identificación de IRBL conocidas y la caracterización de nuevas enzimas. Recientemente se ha descrito una técnica de biología molecular capaz de detectar modificaciones genéticas, que utilizando un amplio grupo de enzimas como patrón permite una rápida identificación de los genes plasmídicos implicados en la resistencia enzimática a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas en enterobacterias (12).

La presencia en una cepa de diversos mecanismos de resistencia al mismo antimicrobiano no es un hecho infrecuente y, sin duda, complica su estudio. Así, cepas productoras de betalactamasas de espectro ampliado a menudo producen también betalactamasas tipo TEM o SHV, y si estas enzimas clásicas se sintetizan en suficiente cantidad pueden producir resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas y con ello fenotipos de más difícil lectura. Recientemente ha sido identificada en Francia (11) una mutante compleja de la betalactamasa TEM-1 con mutaciones localizadas tanto en la IRBL TEM-33 como en la betalacta