• Inhibición de mecanismos de permeabilidad y bombeo
• Mecanismos de inhibición debetalactamasas
• Mecanismos de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas
• Farmacodinamia y actividad no enzimática de los inhibidores de betalactamasas
• Problemas de la detección de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasasen el laboratorio
• Evolución de la resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas
• Reevaluación de los efectos gastrointestinales delos betalactámicos-inhibidores de betalactamasas
• Inhibidores de betalactamasas en el género Haemophilus
• Inhibidores de betalactamasas en Streptococcus pneumoniae
• Actividad de los inhibidores de betalactamasas frente a Acinetobacter baumannii
• Betalactámicos-inhibidores de betalactamasas en Mycobacterium

Inhibición de mecanismos de permeabilidad y bombeo .

J.L. Martínez

Centro Nacional de Biotecnología (CSIC), Campus UAM, Cantoblanco, Madrid.

Uno de los mayores problemas para el tratamiento de las infecciones debidas a ciertas familias de bacterias es su baja sensibilidad intrínseca a distintos antibióticos. Esto es particularmente grave en el caso de patógenos oportunistas como Pseudomonas y otros géneros bacterianos filogenéticamente cercanos y que dan cuenta de un porcentaje elevado de las infecciones hospitalarias. El punto de vista tradicional indicaba que el motivo por el cual estas bacterias eran poco sensibles a los antibióticos era su baja permeabilidad a distintos compuestos (1).

Sin embargo, más recientementemente se ha visto que la explicación no es tan sencilla. A finales de los años 1980 se describió por vez primera la existencia de sistemas capaces de expulsar de un modo activo a los antibióticos hacia el exterior de las bacterias, y desde mediados de la presente década se ha venido caracterizando un número cada vez mayor de dichos sistemas. Los sistemas de bombeo de antibióticos en las bacterias gramnegativas constan de tres proteínas: una presente en la membrana citoplásmica, otra en la membrana externa y otra que actúa como unión entre ambas. El sistema está acoplado, para su funcionamiento, al potencial de membrana. En el caso de las bacterias grampositivas el sistema es más sencillo, con una única proteína implicada en el transporte de fármacos, cuya actividad es dependiente de ATP. Es de notar que estos sistemas de transporte son muy homólogos, tanto estructural como funcionalmente, a sistemas de transporte de fármacos implicados en la resistencia a agentes anticancerígenos. Otro aspecto importante de los sistemas de bombeo de antibióticos es que tienen un rango de sustrato muy amplio, recibiendo en consecuencia el nombre de Multi-Drug-Resistance systems (MDR) (2).

En cuanto a su distribución, hay sistemas que sólo están presentes en algunas cepas de una especie bacteriana, pero la gran mayoría se encuentran en el genoma de todos los individuos pertenecientes a dicha especie (3). En nuestro laboratorio hemos demostrado que los tres sistemas de bombeo descritos hasta el momento en P. aeruginosa están presentes tanto en cepas de origen clínico como de origen medioambiental (datos no publicados). Asimismo, hemos demostrado la existencia de sistemas MDR, inducibles por metales pesados, en enterobacterias de origen medioambiental (4). Esto da idea de que los sistemas de bombeo son ubicuos y, de hecho, el análisis de secuencias completas de microorganismos indica su presencia en los cromosomas de todas las bacterias caracterizadas. La única diferencia entre cepas resistentes y sensibles consiste en que, en las primeras, el sistema MDR se expresa de modo constitutivo como consecuencia de mutaciones en sus elementos reguladores. Por otra parte, a pesar de que los sistemas MDR no se expresan en condiciones habituales de cultivo en el laboratorio, cabe destacar que han de tener una función in vivo. Su expresión ha de ser inducible bajo ciertas condiciones, y esto puede producir fenómenos de resistencia fenotípica en el punto de la infección, no detectables mediante técnicas rutinarias de análisis en el laboratorio (5).

El hecho de que los sistemas MDR sean ubicuos e intervengan en el bombeo de numerosos antibióticos los convierte en blancos ideales para la búsqueda de nuevos inhibidores bacterianos, capaces de hacer a las bacterias que portan estos sistemas más sensibles a los antibióticos actualmente existentes en el repertorio clínico. Se ha determinado también que mutantes de Escherichia coli y P. aeruginosa en los cuales se han inactivado sistemas MDR se hacen más sensibles a distintos antibióticos. Estos datos indican que los inhibidores de sistemas MDR pueden tener interés terapéutico, y no sólo para el tratamiento de la infeccion, sino para evitar la emergencia de mutantes resistentes que requieran una doble mutación para producir su fenotipo. En este sentido se ha descrito que el tratamiento con reserpina, un inhibidor de los sistemas de bombeo de bacterias grampositivas, disminuye la frecuencia de emergencia de mutantes resistentes a las quinolonas en dichas bacterias (6). Por otra parte, se ha visto que en la mayor parte de los aislamientos clínicos la resistencia a las quinolonas está asociada a la presencia de mutaciones en topoisomerasas conjuntamente con una sobreexpresión de sistemas MDR, lo cual indica que probablemente son necesarias ambas mutaciones para dar lugar a una resistencia de relevancia clínica (7).

A pesar del interés que pueden tener, no existen todavía inhibidores de sistemas de bombeo con aplicación terapéutica, aunque hay compañías farmacéuticas que están trabajando de modo muy activo para conseguirlos. Los futuros inhibidores podrían ser de tres clases:

a) Inhibidores de la fuente de energía requerida para el funcionamiento de los sistemas MDR: inhibidores del potencial de membrana (CCCP) o de la actividad ATPasa (reserpina) que se utilizan en el laboratorio en la actualidad para caracterizar los sistemas MDR, pero su alta toxicidad hace que no sean adecuados para uso terapéutico.

b) Inhibidores directos de las bombas: moléculas que interaccionarían con las bombas inactivándolas irreversiblemente de un modo semejante a los inhibidores de betalactamasas. En nuestro grupo hemos obtenido anticuerpos específicos contra un sistema de bombeo de Stenotrophomonas maltophilia y su uso permite disminuir los valores de CMI de distintos antibióticos.

c) Inhibidores de los sistemas reguladores de la expresión de las bombas. La expresión de los sistemas MDR tiene una regulación compleja que se conoce poco. Se sabe, por ejemplo, que en algunos casos su expresión se activa por salicilato. La utilización de análogos estructurales capaces de unirse al activador, pero impidiendo que actúe como tal, podrían ser de utilidad para la inhibición de los sistemas MDR.

Como resumen cabe destacar que el desarrollo de inhibidores de MDR prodría contribuir de modo muy significativo a mejorar la actividad de los antibióticos que se utilizan en la actualidad. Dado que los sistemas MDR tienen una funcionalidad, que no conocemos, distinta de la resistencia a antibióticos, estos inhibidores incluso podrían tener una actividad antibacteriana directa.

Bibliografía

1. Nikaido, H. Prevention of drug access to bacterial targets: Permeability barriers and active efflux. Science 1994; 264: 382-388.
2. Paulsen, I.T., Brown, M.H., Skurray, R.A. Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiol Rev 1996; 60: 575-608.
3. Saier, M.H., Paulsen, I.T., Sliwinski, M.K., Pao, S.S., Skurray, R.A., Nikaido, H. Evolutionary origins of multidrug and drug-specific efflux pumps in bacteria. FASEB J 1998; 12: 265-274.
4. Hernández, A., Mellado, R.P., Martínez, J.L. Accumulation and vanadium-induced multidrug resistance by environmental isolates of Escherichia hermannii and Enterobacter cloacae. Appl Environ Microbiol 1998; 64: 4317-4320.
5. Martínez, J.L., Blázquez, J., Baquero, F. Non-canonical mechanisms of antibiotic resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 1015-1022.
6. Markham, P.N., Neyfakh, A.A. Inhibition of the multidrug transporter NorA prevents emergence of norfloxacin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 2673-2674.
7. Martínez, J.L., Alonso, A., Gómez-Gómez, J.M., Baquero, F. Quinolone resistance. Just the tip of the iceberg? J Antimicrob Chemother; en prensa.

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Mecanismos de inhibición debetalactamasas.

M.J. Fresnadillo

Departamento de Microbiología, Hospital Universitario, Salamanca.

La producción de betalactamasas constituye el principal mecanismo de resistencia a los antibióticos betalactámicos, fundamentalmente en gramnegativos, y ha motivado que gran parte de los esfuerzos, en el ámbito de estos antimicrobianos, se haya centrado en el diseño de estrategias encaminadas a neutralizar y contrarrestar su acción. Las desarrolladas hasta la actualidad incluyen la síntesis de análogos estables a la degradación enzimática, el desarrollo de preparados con poca afinidad por las betalactamasas, el empleo de sustancias bloqueantes y la utilización de inhibidores de betalactamasas en combinación con "auténticos antimicrobianos", a los que protegen de la inactivación enzimática.

Las primeras aproximaciones en la lucha contra las betalactamasas se realizaron durante los años 1940 y 1950, e incluyeron el empleo de un suero antibetalactamasa (1) y de diversos compuestos orgánicos (laurilsulfato, benzoato y sulfanilato sódicos, xilocaína, 2 bencilimidazol, etc.), pero los resultados fueron desalentadores (2) (incluso, en el caso del suero antibetalactamasa, se produce una activación de determinadas enzimas) (3) y no se logró encontrar ningún agente clínicamente utilizable. El descubrimiento de la cefalosporina C (4) y de las primeras penicilinas semisintéticas (meticilina, nafcilina e isoxazolpenicilinas) marca el verdadero comienzo del desarrollo de los inhibidores de betalactamasas, ya que se muestran estables a la hidrólisis y actúan como inhibidores competitivos al asociarse a un betalactámico lábil. Sin embargo, esta estrategia carece de utilidad práctica porque las penicilinas antiestafilocócicas atraviesan con gran dificultad la pared de los bacilos gramnegativos y por tanto no llegan al espacio periplásmico, donde se encuentran las enzimas. A pesar de este "fracaso", los resultados obtenidos animaron a diversos grupos de investigadores a dirigir sus esfuerzos a la búsqueda de moléculas con capacidad inhibitoria frente a las betalactamasas. Así, en 1967 se inicia en los Laboratorios Beecham un programa de investigación encaminado a detectar metabolitos microbianos con actividad inhibitoria de betalactamasas, que tuvo como consecuencia el descubrimiento de los ácidos olivánicos a partir de una cepa de Streptomyces olivaceus (5) y del ácido clavulánico producido por Streptomyces clavuligerus (cepa ATCC 27064) (6). El ácido clavulánico muestra escasa actividad antimicrobiana pero una importante capacidad de inhibir algunas betalactamasas, por lo que se convirtió en el prototipo de molécula con dicha función y "validó" la eficacia de esta estrategia.

Con posterioridad se descubrieron otros inhibidores: en 1978 el sulbactam (Barth en laboratorios Pfizer), en 1980 la sultamicilina (Bigham) (un doble éster o profármaco mutuo de sulbactam y ampicilina) y en 1984 el tazobactam (Micetich para laboratorios Taiho). Los derivados halogenados del ácido penicilánico, ácidos 6b-bromo (brobactam) y 6ß-iodo penicilánico también son buenos inhibidores de betalactamasas, comparables al ácido clavulánico, aunque aún no se han introducido en clínica. El ácido 6b-cloro penicilánico posee menor capacidad de inhibición. Sin embargo, la diana prioritaria de todas estas moléculas son las betalactamasas de la clase A, por lo que la investigación continúa, fundamentalmente encaminada hacia la búsqueda de moléculas con actividad frente a las clases B y C. Así, los últimos compuestos estudiados, todos con estructura betalactámica y pertenecientes a diferentes grupos [carbacefémicos (RO 485545, RO488724, RO 488391), sulfonas del ácido penicilánico (SYN 1849, SYN 1852, SYN 1903, RO 481220, RO 481256, CL 186190, GD 40), derivados halogenados (GD 40), monobactámicos (RO 481256, EP 508234, JP 93186468, SYN 2190), etc.] muestran una capacidad inhibitoria frente a las betalactamasas plasmídicas y cromosómicas de la clase C mayor que la del ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam, y se han descrito compuestos (LL10G568a, LL10G568b, diferentes derivados del ácido mercaptoacético) que inhiben metaloenzimas hidrolizantes de carbapenémicos y cefamicinas (betalactamasas de la clase B) (7-10).

Las moléculas que actúan como inhibidores de betalactamasas pueden hacerlo según un mecanismo competitivo, si el inhibidor y el sustrato (betalactámico sensible a betalactamasas) compiten por el lugar activo de la enzima, o no competitivo. La inhibición competitiva tiene lugar con moléculas que poseen estructura química betalactámica. Puede producirse por dos mecanismos fundamentales: formación de complejos enzima-sustrato sin o con interacciones químicas (reversible e irreversible) y "bloqueo " por sustratos "pobres" o "perezosos" que son degradados muy lentamente (sustratos competitivos). Se comportan de esta forma las penicilinas antiestafilocócicas (meticilina, nafcilina e isoxazolpenicilinas), la temocilina, las cefamicinas, el aztreonam, los carbapenémicos, etc. (10).

A su vez, la inhibición puede ser reversible si la enzima recupera su acción después de desligarse del inhibidor (isoxazolpenicilinas) e irreversible si la enzima permanece inactiva incluso después de liberarse del inhibidor, debido a que se produce una alteración química y conformacional de la enzima. A este último grupo pertenecen diversas sustancias que reaccionan covalentemente con aminoácidos de la enzima, inhibidores dirigidos al grupo activo de la enzima y un grupo conocido como inhibidores "suicidas" porque en el proceso se autodestruyen. El ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam se comportan eminentemente como inhibidores suicidas, aunque sus características cinéticas pueden verse modificadas dependiendo de la enzima. El tipo de inhibición que producen es, a su vez, competitiva por motivos estructurales, selectiva y progresiva en función del tiempo y de la concentración de inhibidor (11).

El primer paso de la reacción entre betalactamasa e inhibidor suicida es el posicionamiento de la molécula del inhibidor en el centro activo de la enzima. El inhibidor y el grupo catalítico no sólo deben estar próximos sino también alineados convenientemente, de modo que pueda formarse un complejo previo a la acilación. Las uniones son débiles y se establecen mediante puentes de hidrógeno y uniones electrostáticas, por lo que este complejo tiene carácter reversible. El ataque nucleofílico del grupo carbonil del inhibidor por el OH de la serina 70 en conjunción con los radicales activos del glutámico 166, la lisina 73, la serina 130 y la lisina 234 (en las betalactamasas del grupo A) y la posterior rotura del anillo no betalactámico dan lugar a la formación de un complejo covalente acil-enzima, a varios compuestos de transición y a compuestos lineales, sin actividad enzimática e irreversibles debido a la ausencia de un paso de desacilación, existente en el ataque a sustratos sensibles, necesario para la regeneración de la enzima (12-14).

Bibliografía

1. Perlstein, D., Liebmann, A.J. The in vitro protection of penicillin from penicillinase. Science 1945; 102: 174-175.
2. Behrens, O.K., Garrison, L. Inhibitors for penicillinase. Arch Biochem 1950; 27: 94-98.
3. Richmond, M.H. Purification and properties of the exopenicillinase from Staphylococcus aureus. Biochem J 1963; 83: 452-459.
4. Abraham, E.P., Newton, G.G.F. Comparison of the action of penicillinase on benzylpenicillin and cephalosporin N and the competitive inhibition of penicillinase by cephalosporin C.
5. Brown, A.G., Butterworth, D., Cole, M., Hanscomb, G., Hood, J.D., Reading, C., Rolison, G.N. Naturally-ocurring ß-lactamase inhibitors with antibacterial activity. J Antibiot (Tokyo) 1976; 29: 668-669.
6. Reading, C., Cole, M. Clavulanic acid: A betalactamase-inhibiting beta-lactam from Streptomyces clavuligerus. Antimicrob Agents Chemother 1977; 11: 852-857.
7. Bush, K., Sykes, B. ß-lactamase inhibitors in perspective. J Antimicrob Chemother 1983; 11: 97-107.
8. Medeiros, A.A. Evolution and dissemination of ß-lactamases accelerated by generations of ß-lactam antibiotics. Clin Infect Dis 1997; 24 (Suppl. 1): 19-45.
9. Wise, R. ß-lactamase inhibitors. J Antimicrob Chemother 1982; 9 (Suppl. B): 31-40.
10. Rolinson, G.N. Evolution of ß-lactamase inhibitors. Rev Infect Dis 1991; 13 (Suppl. 9): 727-732.
11. Matagne, A., Lamotte-Braseur, J., Frére, J.M. Catalitye properties of class A ß-lactamases: Efficiency and diversity. Biochem J 1998; 330: 581-598.
12. Livermore, D.M. Determinants of the activity of ß-lactamase inhibitor combinations. J Antimicrob Chemother 1993; 31 (Suppl. A): 9-21.
13. Ghuysen, J.M. Molecular structures of penicillin binding proteins and ß-lactamases. Trends Microbiol 1994; 2: 372-380.
14. Imtiaz, U., Billings, E.M., Knox, J.R., Mobashery, S. A structure-based analysis of the inhibition of class A ß-lactamases by sulbactam. Biochemistry 1994; 33: 5728-5738.

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Mecanismos de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas.

J. Blázquez

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

La hidrólisis enzimática, las mutaciones en las dianas (PBP), las bombas de flujo y las mutaciones que impiden o reducen la entrada del antibiótico constituyen los principales mecanismos de resistencia a los antibióticos betalactámicos en las bacterias patógenas. A pesar de la diversidad de mecanismos, el más común es la presencia de enzimas capaces de hidrolizar el anillo betalactámico, las betalactamasas, y convertir a estos antibióticos en inactivos. Durante años se ha tratado de evitar la resistencia a los betalactámicos mediante el desarrollo de nuevas moléculas, ya sean resistentes a la hidrólisis (como las cefalosporinas de tercera generación) ya sean inhibidoras de la actividad hidrolítica (como el ácido clavulánico). La evolución y diseminación de las betalactamasas parece ser consecuencia de la evolución y el consumo de antibióticos betalactámicos. La gran cantidad de variantes de betalactamasas que existe da idea de la enorme presión selectiva a que han sido sometidas. Se conocen, por ejemplo, más de 60 variantes de betalactamasas de tipo TEM, fruto solamente de entre uno y cinco cambios en las secuencias de TEM-1 o TEM-2 (1, 2). Con estos pocos cambios, las betalactamasas de tipo TEM son capaces de ampliar su espectro de sustratos (betalactamasas de espectro ampliado, BLEA), hidrolizando las nuevas moléculas desarrolladas precisamente para evitar dicha hidrólisis.

Como en el caso de las cefalosporinas de tercera generación, las bacterias patógenas han respondido al desarrollo y uso de los inhibidores de betalactamasas. La resistencia a los inhibidores de betalactamasas en patógenos productores de este tipo de enzimas se debe principalmente a dos mecanismos: betalactamasas variantes con sensibilidad disminuida (3) o hiperproducción de la enzima (4). Además, estos dos mecanismos pueden aparecer unidos a otros, como una disminución de la entrada del inhibidor y la presencia de bombas de flujo. De forma similar a las BLEA, uno o varios cambios en determinadas posiciones de estas enzimas las convierten en más resistentes a la acción de los inhibidores. Hasta hace muy poco, la resistencia a las nuevas cefalosporinas y la resistencia a los inhibidores se encontraba segregada en este tipo de enzimas. Incluso, y debido a los resultados obtenidos en el laboratorio con genes híbridos, se pensó en la imposibilidad de la coexistencia de los dos tipos de mutaciones en la misma molécula de proteína. Desgraciadamente ya se ha descrito la primera betalactamasa de tipo TEM con actividad aumentada contra las cefalosporinas de tercera generación y sensibilidad disminuida a los inhibidores de betalactamasas (5). La experiencia de los últimos años nos demuestra que, debido a la gran capacidad de variación y adaptación que poseen los microorganismos, es muy posible que estas betalactamasas mutantes se encuentren con frecuencia en un futuro y que además sean cada vez más eficaces.

El mundo microbiano ha sabido responder a cada una de las estrategias empleadas para luchar contra la producción de betalactamasas. Sin embargo, a pesar del desarrollo de un enorme número de variantes enzimáticas, las bacterias poseen aún otro recurso: las betalactamasas de clase C. Estas enzimas, codificadas en el cromosoma de muchos gramnegativos y de la mayor parte de las enterobacterias, poseen la capacidad de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación y son, además, naturalmente resistentes a la inhibición por los inhibidores clásicos. Además, la producción de la mayoría de estas enzimas es inducible indirectamente por la acción de los betalactámicos, e incluso por los inhibidores de betalactamasas. El ácido clavulánico, por ejemplo, ejerce una acción paradójica sobre la producción de la enzima AmpC en algunos gramnegativos como Enterobacter cloacae: a pesar de inhibir sólo débilmente la actividad de AmpC, es capaz de inducir la transcripción del gen (AmpC) que codifica para la betalactamasa cromosómica. La creciente aparición de aislamientos clínicos portadores de betalactamasas de tipo AmpC codificadas en plásmidos (6), y por lo tanto transmisibles entre diferentes cepas, junto con el aislamiento de las primeras variantes naturales de AmpC con actividad incrementada contra cefalosporinas (7, 8), complica todavía más el panorama para los antibióticos betalactámicos y los inhibidores de betalactamasas. Además, se ha demostrado que no se puede descartar la aparición de variantes de AmpC capaces de conferir resistencia a las cefalosporinas de cuarta generación (9). Se hace necesario, por lo tanto, el desarrollo de nuevas moléculas inhibidoras que actúen sobre las betalactamasas de tipo AmpC. Para ser completamente eficaces, estas nuevas moléculas no deberían ser afectadas por los mecanismos habituales de resistencia a los inhibidores betalactámicos, como mutaciones en porinas, bombas de flujo y adquisición de mutaciones enzimáticas que disminuyan la afinidad por la molécula. Según esto, parece adecuado el estudio y desarrollo de inhibidores no betalactámicos de betalactamasas de tipo AmpC (10).

Bibliografía

1. Knox, J. Extended-spectrum and inhibitor resistant TEM-type ß-lactamases: Mutations, specificity, and three-dimensional structure. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2593-2601.
2. Bush, K., Jacoby, G. http://www.lahey.org/studies/webt.htm.
3. Blázquez, J., Baquero, M.R., Cantón, R., Alós, I., Baquero, F. Characterization of a new TEM-type ß-lactamase resistant to clavulanate, sulbactam and tazobactam in a clinical isolate of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1993; 38: 2059-2063.
4. Martínez, J.L., Vicente, M.F., Delgado-Iribarren, A., Pérez-Díaz, J.C., Baquero, F. Small plasmids are involved in amoxicillin-clavulanate resistance in Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33: 595.
5. Sirot, D., Recule, C., Chaibi, E.B., Bret, L., Croize, J., Chanal-Claris, C., Labia, R., Sirot, J. A complex mutant of TEM-1 ß-lactamase with mutations encountered in both IRT-4 and extended-spectrum TEM-15, produced by an Escherichia coli clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1322-1325.
6. González-Leiza, M., Pérez-Díaz, J.C., Ayala, J., Casellas, J.M., Martínez-Beltrán, J., Bush, K., Baquero, F. Gene sequence and biochemical characterization of FOX-1 from Klebsiella pneumoniae, a new AmpC-type plasmid-mediated ß-lactamase with two molecular variants. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 2150-2157.
7. Nukaga, M., Haruta, S., Tanimoto, K., Kogure, K., Taniguchi, K., Tamaki, M., Sawai, T. Molecular evolution of a class C ß-lactamase extending its substrate specificity. J Biol Chem 1995; 270: 5729-5735.
8. Bauernfeind, A., Schneider, I., Meyer, D., Jungwirth, R., Chong, Y., Lee, K. Possible role of amino-acid substitution at position 346 on the ceftazidime-hydrolyzing activity of the cephamycinase CMY-1. 37th ICAAC, Toronto; abstract.
9. Morosini, M.I., Negri, M.C., Schoichet, B., Baquero, M.R., Baquero, F., Blázquez, J. An extended-spectrum AmpC-type ß-lactamase obtained by in vitro antibiotic selection. FEMS Microbiol Lett 1998; 165: 85-90.
10. Weston, S., Blázquez, J., Baquero, F., Shoichet, B. Structure-based enhancement of boronic acid-based inhibitors of AmpC ß-lactamases. J Med Chem 1998; 41: 4577-4586.

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Farmacodinamia y actividad no enzimática de los inhibidores de betalactamasas

L. Aguilar1, M.J. Giménez1 y M. Gómez-Lus2

1Departamento Médico, SmithKline Beecham, S.A., Madrid; 2Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid.

El objetivo de la farmacodinamia como disciplina es estudiar las interacciones de fármaco y diana (1). En el caso de los inhibidores de betalactamasas, como su propio nombre indica, la diana de actuación es dicha enzima bacteriana. Sin embargo, para completar el estudio de la acción de estos compuestos, entre los que cabe destacar al ácido clavulánico, como estrategia de inhibición de los mecanismos de resistencia bacterianos, parece necesario explorar su acción sobre la diana celular, a pesar de su nulo efecto antibacteriano clásico propio (2), así como el efecto sobre la acción de los fagocitos polimorfonucleares como primera línea de defensa antibacteriana.

Desde un punto de vista farmacodinámico se ha investigado la acción antienzimática del ácido clavulánico (efecto de concentraciones variables que simulan las concentraciones séricas obtenidas a lo largo del intervalo de dosificación) sobre la actividad betalactamasa bacteriana considerando tres aspectos:

1) Decremento de la actividad betalactamasa a lo largo del tiempo. Este decremento se obtuvo con ácido clavulánico, a pesar del mantenimiento de la viabilidad bacteriana, en experimentos realizados con Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus (3).

2) Efecto postbetalactamasa (definido como decremento de la actividad betalactamasa con respecto a un control tras la desaparición del inhibidor del medio). El ácido clavulánico ha demostrado presentar un efecto postbetalactamasa superior a cuatro horas para H. influenzae y S. aureus (3).

3) Mantenimiento del efecto postantibiótico por el efecto postbetalactamasa (anteriormente definido) y la presencia de concentraciones subinhibitorias del antibiótico, traduciéndose en un mantenimiento del decremento de la viabilidad bacteriana a lo largo del tiempo (S. aureus sensible y resistente a meticilina) (4, 5).

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico sobre la diana celular que han sido detenninadas son:

1) Retraso con respecto al control en el tiempo de generación de S. aureus (4) y Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina (6).

2) Aumento del enlentecimiento del crecimiento de S. pneumoniae producido por concentraciones subinhibitorias de amoxicilina (7).

3) Incremento de la velocidad y la magnitud de la actividad bactericida de la amoxicilina frente a S. pneumoniae resistente a penicilina (7).

4) Aumento de la velocidad de acción bactericida de la amoxicilina sobre la subpoblación resistente de S. aureus heterorresistente (5).

5) Disminución de la CMI de amoxicilina en cepas de H. influenzae no productor de betalactamasa que presentan elevada CMI (8).

Por último, el efecto del ácido clavulánico sobre la acción de los polimorfonucleares en una cepa de S. pneumoniae resistente a penicilina, en presencia de suero humano no inactivado, ha sido estudiada con respecto a:

1) Decremento del inóculo inicial de S. pneumoniae resistente a penicilina en presencia de polimorfonucluares, suero humano y concentraciones fisiológicas de ácido clavulánico (6).

2) Decremento de la viabilidad bacteriana de S. pneumoniae resistente a penicilina por concentraciones subinhibitorias de amoxicilina-ácido clavulánico en presencia de polimorfonucleares y suero humano (7).

3) Consecución de actividad bactericida (definida como una reducción >99% del inóculo inicial) frente a S. pneumoniae resistente a penicilina por parte de concentraciones fisiológicas de amoxicilina-ácido clavulánico tras una hora de incubación en presencia de polimorfonucleares y suero humano (7).

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico sobre S. pneumoniae se basan en la acción de éste sobre la PBP3 (diana no lítica) (9), desestructurando la pared y favoreciendo la actuación de la amoxicilina, la opsonofagocitosis y la muerte intracelular por lisozima (10)..

Las acciones no enzimáticas del ácido clavulánico en presencia o ausencia de factores defensivos del huésped podrían explicar el recientemente descrito (11) aumento de la actividad in vivo frente a S. pneumoniae de amoxicilina-ácido clavulánico en comparación con amoxicilina.

Bibliografía

1. Ross, E.M. Pharmacodynamics. Mechanisms of drug action and the relationship between drug concentration and effect. En: Hardman, J.G., Gilman, A.G., Limbird, L.E. (Eds.). The pharmacological basis of therapeutics, 9th ed. Goodman & Gilman's, New York 1995; 29-41.
2. Rolinson, G.N. A review of the microbiology of amoxycillin/clavulanic acid over the 15 year period 1978-1993. J Chemother 1994; 6: 283-318.
3. Martín, M., Aguilar, L., Balcabao, I.P., Gómez-Lus, M.L., Dal-Ré, R., Prieto, J. In vitro pharmacodynamic simulation of clavulanic acid concentrations: Effect on Staphylococcus aureus and Haemophilus influenzae ß-lactamase activity. J Antimicrob Chemother 1997; 39: 290-292.
4. Aguilar, L., Martín, M., Balcabao, I.P., Gómez-Lus, M.L., Dal-Ré, R., Prieto, J. In vitro assessment of the effect of clavulanic acid at concentrations achieved in human serum on the bactericidal activity of amoxicillin at physiological concentrations against Staphylococcus aureus: Implications for dosage regimens. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1403-1405.
5. Prieto, J., Aguilar, L., Giménez, M.J., Toro, D., Gómez-Lus, M.L., Dal-Ré, R., Balcabao, I.P. In vitro activities of co-amoxiclav at concentrations achieved in human serum against the resistant subpopulation of heteroresistant Staphylococcus aureus: A controlled study with vancomycin. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 1574-1577.
6. Gómez-Lus, M.L., Aguilar, L., Martín, M., Giménez, M.J., Martínez, P., Prieto, J. Intracellular and extracellular killing of a penicillin-resistant, serotype-9 strain of Streptococcus pneumoniae by polymorphonuclear leukocytes in the presence of sub-inhibitory concentrations of clavulanic acid. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 142-144.
7. Martín, M., Gómez-Lus, M.L., Aguilar, L., Martínez, P., Giménez, M.J., Prieto, J. Effect of clavulanic acid and/or polymorphonuclear neutrophils on amoxicillin bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16: 512-516.
8. Aguilar, L., Perea, E., García de Lomas, J., Granizo, J.J. Does clavulanic acid decrease amoxicillin MIC for ß-lactamase negative Haemophilus influenzae strains? En: Second International Meeting on the Therapy of Infections, Florencia 1998; Abstract no. A10, pg. 107.
9. Severin, A., Severina, E., Tomasz, A. Abnormal physiological properties and altered cell wall composition in Streptococcus pneumoniae grown in the presence of clavulanic acid. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 504-510.
10. Prieto, J., Frías, J., Alou, L., Carcas, A. Estudio de la actividad bactericida de la combinación amoxicilina/ácido clavulánico y sus posibles efectos ante la resistencia a betalactámicos de Streptococcus pneumoniae. Med Clin (Barc.) 1998; 110 (Supl. 1): 12-15.
11. Smith, G.M., Slocombe, B., Abbott, K.H., Mizen, L.W. Activity of amoxicillin-clavulanate against penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae in an experimental respiratory infection model in rats. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 813-817.

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Problemas de la detección de resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasasen el laboratorio

F.J. Castillo García

Servicio de Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Zaragoza.

Aunque hay varios mecanismos bioquímicos que pueden explicar la resistencia a los betalactámicos en los bacilos gramnegativos, la biosíntesis de betalactamasas es el más importante. Para superar este problema una de las estrategias más eficaces consiste en la combinación de betalactámicos con inhibidores suicidas de betalactamasas. Así disponemos en la clínica de diferentes inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam) que son particularmente activos frente a las betalactamasas plasmídicas.

La resistencia a la asociación de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas fue descrita por primera vez en nuestro país en 1987 (5). Circunscrita inicialmente a Escherichia coli, se ha observado más recientemente en algunas cepas de Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri y Haemophilus influenzae (7, 12). En E. coli, especie en la que sin duda la resistencia ha alcanzado una mayor difusión, se han descrito varios mecanismos causantes de la disminución de sensibilidad a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas:.

1) Hiperproducción de betalactamasa cromosómica del grupo 1, que es menos sensible que las enzimas del grupo 2 a la acción de los inhibidores de betalactamasas. En algunas cepas la producción de esta betalactamasa está constitutivamente desreprimida por mutaciones en AmpC o por la adquisición de un promotor más fuerte (13). La existencia de cepas que han adquirido la capacidad de producir AmpC vía plásmidos a partir del cromosoma de otras bacterias, tales como Citrobacter sp. o Enterobacter sp., puede expandir en el futuro este mecanismo de resistencia.

2) Algunas betalactamasas plasmídicas, como OXA-1, son menos sensibles que las betalactamasas tipo TEM a la inhibición por inhibidores de betalactamasas, de modo que las cepas que producen estas enzimas son con más frecuencia resistentes a las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas (15).

3) La hiperproducción de betalactamasas plasmídicas de amplio espectro del grupo 2b no modificadas (TEM-1, TEM-2, SHV-1) es un mecanismo muy frecuente de resistencia, que puede deberse a la presencia de plásmidos multicopia o a la existencia de un promotor más potente (8, 10).

4) La modificación en las proteínas de membrana externa OmpF y/o OmpC, que limitan la penetración de las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas, en conjunción con la producción de betalactamasas también confieren resistencia (10).

5) Desde que se identificaron por primera vez en 1989, en Francia y en España (1, 2), se han descrito numerosas mutantes de TEM-1 o TEM-2 (TEM-30 a TEM-41, TEM-44, TEM-45) con modificaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de la enzima que se traducen en una sensibilidad sustancialmente reducida frente a los inhibidores de betalactamasas. Solo hay un informe de un aislamiento clínico en Grecia que posea una IRBL derivada de SHV, la SHV-10 (9). Pertenecen al grupo 2br y se las conoce con el nombre de IRT (inhibitor resistant TEM) o IRBL (inhibitor resistant TEM betalactamases).

Mientras que los mecanismos de resistencia de las otras categorías se encuentran prácticamente circunscritos a E. coli, el potencial de difusión epidémica inherente a un mecanismo de codificación plasmídica, como es la síntesis de IRBL, representa un peligro considerablemente mayor para la actividad de las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas.

Estudios epidemiológicos llevados a cabo en diferentes países europeos han evidenciado que la frecuencia de cada mecanismo de resistencia varía de unas zonas a otras, lo que podría estar en relación con el diferente uso que se hace de los antibióticos betalactámicos en los distintos países (12). La vigilancia en el laboratorio de microbiología clínica del estado de la resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas y el conocimiento de los mecanismos involucrados son fundamentales para garantizar la eficacia clínica e influir en el uso de los diferentes antibióticos betalactámicos en la comunidad y en el medio hospitalario. Ahora bien, para conseguir este objetivo existen algunas dificultades, como la variabilidad en los resultados consecuencia de las diferencias existentes en la metodología utilizada por los distintos laboratorios. Este problema adquiere más importancia si consideramos la relativa frecuencia con que las cepas presentan una disminución de sensibilidad más que valores de CMI pertenecientes a la categoría de resistentes, lo que puede llevar a subestimar la importancia real del problema (13).

La metodología usada para probar la sensibilidad bacteriana a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y en particular a amoxicilina-ácido clavulánico, no está universalmente homologada. Ello lleva a probar este compuesto tanto con una concentración fija de ácido clavulánico (2 µg/ml) como manteniendo una proporción 2:1 entre la amoxicilina y el ácido clavulánico. Cuando se prueban las mismas cepas en las mismas condiciones los resultados varían notablemente según se use la concentración fija o la proporcional del inhibidor. Así, con la relación 2:1 siempre se obtiene mayor porcentaje de cepas sensibles (14). Por tanto, este método puede subestimar el índice global de resistencia y, eventualmente, inducir algún fracaso terapéutico. Si queremos vigilar eficientemente la aparición de cepas portadoras de IRBL, conviene no olvidar que su detección es más probable si se usa una concentración fija de inhibidor en las pruebas de sensibilidad (14).

La lectura interpretativa del fenotipo de resistencia constituye un método universalmente asequible y puede resultar muy útil, al menos para hacer una selección preliminar de las cepas que nos ayude a sospechar el mecanismo de resistencia involucrado y a elegir el método de confirmación que sea necesario.

Cuando la resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas se debe a la sobreproducción de la cefalosporinasa cromosómica del grupo 1, el patrón de resistencia incluye aminopenicilinas, amoxicilina-ácido clavulánico, cefalosporinas de primera y segunda generación y cefamicinas. Se elevan discretamente las CMI de las carboxipenicilinas y ureidopenicilinas, y pueden encontrarse cepas con sensibilidad disminuida a todos los betalactámicos excepto los carbapenémicos (11). La cloxacilinasa OXA-1 no es tan bien inhibida como la TEM-1 por los diferentes inhibidores de betalactamasas. La hiperproducción de esta enzima, además de elevar la CMI de amoxicilina-ácido clavulánico, disminuye la sensibilidad a la cefpiroma (2-8 µg/ml) y a la cefotaxima (0,5-2 µg/ml), sin afectar a la ceftazidima ni al aztreonam (6). Se puede sospechar su presencia en cepas resistentes a aminopenicilinas, carboxipenicilinas y asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y en sensibles a cefalotina (15). El fenotipo de las cepas hiperproductoras de betalactamasas del grupo 2b incluye CMI muy elevadas para aminopenicilinas, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas y en menor grado para la amoxicilina-ácido clavulánico y las cefalosporinas de primera y segunda generación.

Puede producirse también un ligero aumento de las CMI de ceftazidima y aztreonam (6).

Las cepas productoras de IRBL son resistentes a las penicilinas de amplio espectro, solas y en combinación con inhibidores de betalactamasas. Se mantienen sensibles a las cefalosporinas de primera y segunda generación y a las cefamicinas. La resistencia a amoxicilina-ácido clavulánico, junto con la sensibilidad completa a la cefazolina y la cefoxitina, sugieren la presencia de un mecanismo enzimático de resistencia diferente de la hiperproducción de TEM o de las alteraciones de la membrana (2, 3).

La determinación del punto isoeléctrico (pI) mediante isoelectroenfoque analítico es de gran ayuda para confirmar la interpretación fenotípica. Así, las betalactamasas TEM-1, TEM-2 y OXA-1 tienen pI de 5,4, 5,6 y 7,4, respectivamente. Las IRBL tienen pI de 5,4 o 5,2 y las cepas hiperproductoras de betalactamasa cromosómica tienen pI superiores a 8 (3, 4, 13).

Más complicada y laboriosa resulta la determinación de los parámetros cinéticos de las diferentes betalactamasas, así como la secuenciación y la oligotipificación de los genes que codifican la betalactamasa, que resulta obligada para definir las sustituciones en la secuencia de los aminoácidos y con ello la identificación de IRBL conocidas y la caracterización de nuevas enzimas. Recientemente se ha descrito una técnica de biología molecular capaz de detectar modificaciones genéticas, que utilizando un amplio grupo de enzimas como patrón permite una rápida identificación de los genes plasmídicos implicados en la resistencia enzimática a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas en enterobacterias (12).

La presencia en una cepa de diversos mecanismos de resistencia al mismo antimicrobiano no es un hecho infrecuente y, sin duda, complica su estudio. Así, cepas productoras de betalactamasas de espectro ampliado a menudo producen también betalactamasas tipo TEM o SHV, y si estas enzimas clásicas se sintetizan en suficiente cantidad pueden producir resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas y con ello fenotipos de más difícil lectura. Recientemente ha sido identificada en Francia (11) una mutante compleja de la betalactamasa TEM-1 con mutaciones localizadas tanto en la IRBL TEM-33 como en la betalactamasa de espectro ampliado TEM-15 en una cepa de E. coli. Esta enzima confiere resistencia de muy bajo grado a los inhibidores de betalactamasas y de bajo grado a las cefalosporinas de espectro ampliado. Además, el test de sinergia de doble disco fue débilmente positivo. Presentaba por tanto un fenotipo inusual, que inicialmente sugería la presencia de varias betalactamasas o la combinación de diferentes mecanismos de resistencia a betalactámicos, cuando en realidad se trataba de una mutante compleja que combina mutaciones causantes de resistencia a los inhibidores (Leu-69 y Asp-276) y mutaciones causantes de actividad de espectro ampliado (Lis-104 y Ser-238). Es posible que estas mutantes no sean muy rentables para los microorganismos que las albergan, ya que probablemente fuera más beneficioso para la cepa portadora producir simultáneamente dos mutantes de TEM diferentes, una de espectro ampliado y otra IRBL, que producir una mutante doble. Si cada mutante confiriera su propio fenotipo de resistencia, podría esperarse resistencia de alto grado tanto a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas como a las cefalosporinas de espectro ampliado (11).

Bibliografía

1. Belaaouaj, A., Lapoumeoulie, C., Vedel, G. y cols. Amino-acid 241 of TEM-1 is highly critical in conferring resistance to ampicillin-clavulanate acid combination: Molecular characterization of a natural mutant. En: Program and Abstracts of the 31st ICAAC (Chicago). American Society for Microbiology, Washington DC 1991; 256, Abstr. no. 944.
2. Blázquez, J., Baquero, M.R., Cantón, R., Alós, I., Baquero, F. Characterization of a new TEM-type ß-lactamase resistant to clavulanate, sulbactam and tazobactam in a clinical isolate of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 2059-2063.
3. Caniça, M.M., Barthélémy, M., Gilly, L., Labia, R., Krishnamoorthy, R., Paul, G. Properties of IRT-14 (TEM-45), a newly characterized mutant of TEM-type ß-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 374-378.
4. Henquell, C., Chanal, C., Sirot, D., Labia, R., Sirot, J. Molecular characterization of nine types of mutants among 107 inhibitor-resistant TEM ß-lactamases from clinical isolates of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 427-430.
5. Martínez, J.L., Cercenado, E., Rodríguez-Creixems, M., Vicente-Pérez, M.F., Delgado-Iribarren, A., Baquero, F. Resistance to beta-lactam/clavulanate. Lancet 1987; ii: 1473.
6. Martínez-Beltrán, J. Amoxicilina/ácido clavulánico y ß-lactamasas. En: J.A. García-Rodríguez (Ed.). Amoxicilina/ácido clavulánico, antibiótico del siglo XXI. IM&C, Madrid 1996; 23-40.
7. Nordmann, P. Trends in ß-lactam resistance among Enterobacteriaceae. CID 1998; 27 (Suppl. 1): S100-S106.
8. Pei-Jun, W., Shannon, K., Phillips, I. Mechanisms of hyperproduction of TEM-1 ß-lactamase by clinical isolates of Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 1995; 36: 927-939.
9. Prinarakis, E.E., Miriagou, V., Tzelepi, E., Gazouli, M., Tzouvelekis, L.S. Emergence of an inhibitor-resistant ß-lactamase (SHV-10) derived from an SHV-5 variant. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 838-840.
10. Reguera, J.A., Baquero, F., Pérez-Díaz, J.C., Martínez, J.L. Factors determining resistance to ß-lactam combined with ß-lactamase inhibitors in Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 1991; 27: 569-75.
11. Sirot, D., Recule, C., Chaibi, E.B., Bret, L., Croize, J., Chanal-Claris, C., Labia, R., Sirot, J. A complex mutant of TEM-1 ß-lactamase with mutations encountered in both IRT-4 and extended-spectrum TEM-15, produced by an Escherichia coli clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1322-1325.
12. Speldooren, V., Heym, B., Labia, R., Nicolas-Chanoine, M.H. Discriminatory detection of inhibitor-resistant ß-lactamases in Escherichia coli by single- strand conformation polymorphism-PCR. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 879-884.
13. Stapleton, P., Pei-Jun, W., King, A., Shannon, K., French, G., Phillips, I. Incidence and mechanisms of resistance to the combination of amoxicillin and clavulanic acid in Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2478-2483.
14. Thomson, C.J., Miles, R.S., Amyes, S.G.B. Susceptibility testing with clavulanic acid: Fixed concentration versus fixed ratio. Antimicob Agents Chemother 1995; 39: 2591-2592.
15. Zhou, X.Y., Bordon, F., Sirot, D., Kitzis, M.D., Gutmann, L. Emergence of clinical isolates of Escherichia coli producing TEM-1 derivates or an OXA-1 b-lactamase conferring resistance to b-lactamase inhibitors. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 1085-1089.

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Evolución de la resistencia a betalactámicos-inhibidores de betalactamasas.

J.I. Alós

Servicio de Microbiolobía, Hospital de Móstoles, Madrid.

Desde la década de 1980 se han usado las asociaciones de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas para restablecer la actividad de los betalactámicos frente a patógenos tan importantes en humanos como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, al poco de la introducción en clínica de las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, e incluso antes, se encontraron cepas de E. coli resistentes a la amoxicilina-ácido clavulánico. En E. coli existen varios mecanismos de resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas. Uno de ellos es la producción de cantidades elevadas de la betalactamasa TEM-1, la mas común en esta especie, generalmente debida a pequeños plásmidos multicopia o a mutaciones en el promotor. Alteraciones de la permeabilidad por modificación de las porinas junto con una producción "normal" de TEM-1 constituyen otro mecanismo. Otra posibilidad es la hiperproducción de su betalactamasa cromosómica, al no ser ésta sensible a los inhibidores de betalactamasas. También se ha descrito la producción de betalactamasa plasmídica del tipo OXA-1, mucho menos sensible a la inhibición por los inhibidores de betalactamasas que las del tipo TEM o SHV. Por último, en años recientes han surgido betalactamasas con afinidad disminuida por los inhibidores de betalactamasas (betalactamasas resistentes a inhibidores, BLRI). Las BLRI presentan propiedades cinéticas alteradas en su interacción tanto con los betalactámicos como con los inhibidores de betalactamasas. Los primeros ejemplos de BLRI se dieron en mutantes conseguidos en el laboratorio con oligonucleótidos degenerados. Las enzimas, derivadas de TEM-1, presentaban sustituciones de la metionina de la posición 69 (esquema de numeración de Ambler) por aminoácidos alifáticos hidrófobos tales como la leucina, la valina o la isoleucina. Poco después se aislaron de muestras clínicas las primeras cepas con BLRI. En E. coli han surgido como resultado de mutaciones únicas o múltiples en los genes estructurales de las betalactamasas TEM-1 y TEM-2 y, más raramente, de SHV y de OXY. En aquéllas derivadas de TEM-1 o de TEM-2, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 69, 244, 275 y 276, solas o en combinación con otras, se consideran la causa de la resistencia a los inhibidores de betalactamasas.

En E. coli la incidencia y los mecanismos de resistencia a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas varían mucho según el lugar geográfico. En un estudio realizado en Londres con cepas aisladas entre 1990 y 1994 se encontró que aproximadamente el 5% (el 10% a 15% de las resistentes a ampicilina) eran resistentes o intermedias a amoxicilina-ácido clavulánico y que había pocos cambios en esos cinco años. El principal mecanismo era la hiperproducción de TEM-1 (el 61% de las cepas), seguido de la producción de OXA-1 (el 15%) y de la hiperproducción de betalactamasa cromosómica (el 13%), siendo raras las BLRI. En Francia, en 1993, casi un 25% de los E. coli aislados de orina en un hospital y un 10% de la comunidad eran resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. La cuarta parte de los del hospital y casi la mitad de la comunidad presentaban un patrón de antibiograma sugestivo de la presencia de BLRI, que confirmaron con métodos moleculares. Posteriores estudios sobre éstas y otras cepas demostraron la diversidad de clones, definidos por ribotipificación, y la gran diversidad de genes que codifican BLRI derivadas de TEM causantes de resistencia. En España, un 20% a 33% de los aislamientos de E. coli extrahospitalarios no son sensibles a las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, aunque en nuestra experiencia actual (1998) es rara la presencia de BLRI.

En otras especies de bacilos gramnegativos importantes en clínica, como K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis y Citrobacter freundii, también se han encontrado recientemente BLRI. En EE.UU. se han descrito varias cepas de H. influenzae productoras de betalactamasa y resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. Aunque el mecanismo exacto no se conoce, hay que tener en cuenta que TEM-1 es la betalactamasa más frecuente en esta especie, por lo que no sería de extrañar la presencia de BLRI.

Las bacterias con betalactamasas TEM-1, TEM-2, SHV-1 y OXY sufrieron una fuerte presión selectiva al introducirse en clínica las asociaciones de betalactámico e inhibidor de betalactamasas, y como consecuencia hubo una evolución convergente por mutaciones en los genes estructurales de esas betalactamasas que dio lugar a las BLRI. Su posible extensión debe vigilarse constantemente en estudios epidemiológicos que las busquen por métodos fenotípicos y las caractericen por métodos moleculares.

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Reevaluación de los efectos gastrointestinales delos betalactámicos-inhibidores de betalactamasas

B. Sádaba

Servicio de Farmacología Clínica, Clínica Universitaria, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona

Ha sido necesario el desarrollo de inhibidores de betalactamasas, una familia de enzimas que pueden hidrolizar el anillo betalactámico, para devolver e incluso mejorar la actividad antimicrobiana de diferentes antibióticos betalactámicos. Hoy en día este grupo de fármacos lo constituyen tres compuestos, el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam, con diferencias en cuanto a su potencia inhibidora. Comercializadas en España existen las asociaciones ácido clavulánico-amoxicilina, tazobactam-piperacilina y sulbactam-ampicilina. La primera puede administrarse por vía oral o parenteral y las dos últimas solo por vía parenteral.

La asociación de estos inhibidores a los betalactámicos, además de modificar su espectro antimicrobiano, también puede tener repercusión sobre la tolerabilidad de estos fármacos, aunque es difícil valorar los efectos secundarios de estos inhibidores de betalactamasas debido a que nunca se administran solos, sino en asociación con dosis mucho más altas que las de los propios inhibidores.

Según las fichas técnicas de los productos, los efectos adversos de estas asociaciones son:

En el caso del betalactámico solo, sin asociación con el inhibidor, las reacciones adversas recogidas en la ficha técnica son las siguientes:

Si nos ceñimos a las reacciones adversas gastrointestinales puede observarse que existen diferencias en la frecuencia de aparición según se considere el betalactámico solo o en asociación con el inhibidor de betalactamasas. Hasta la fecha no se han realizado estudios comparativos entre el betalactámico y su asociación con un inhibidor, pero se ha intentado estudiar este efecto desde las reacciones adversas recogidas en los sistemas de farmacovigilancia desarrollados en muchos países, basados en la comunicación voluntaria de estos sucesos.

Dentro de las reservas con que deben asumirse estas conclusiones, parece claro que existe una mayor incidencia de diarrea en los pacientes tratados con amoxicilina-ácido clavulánico que en los tratados con amoxicilina sola, por vía oral, considerándose una probabilidad de aparición 2,36 superior (1).

Entre los efectos adversos gastrointestinales, los comunicados con mayor frecuencia son la diarrea y las náuseas. Aunque la manifestación más grave es la colitis pseudomembranosa, su aparición durante el tratamiento con este grupo de fármacos es excepcional. Por tanto, son otros los motivos de desarrollo de esta alteración durante el tratamiento con betalactámicos asociados a inhibidores de betalactamasas.

Dos son las causas que se consideran en el desarrollo de estos procesos: por una parte la alteración de la flora gastrointestinal saprófita y por otra la producción de trastornos en la motilidad intestinal.

En diferentes estudios se ha observado la aparición de diarrea con aislamiento de diversos microorganismos en heces, debido a la eliminación de parte de la flora saprófita por antibióticos de amplio espectro. Estos hallazgos se evidencian sobre todo en el caso de antibióticos con actividad frente a bacterias anaerobias, puesto que éstas poseen un efecto inhibidor sobre microorganismos potencialmente patógenos. Cuando un antibiótico administrado por vía oral no se absorbe completamente, el riesgo de alteración de la flora intestinal es mayor. Lo mismo ocurre si se produce excreción del antibiótico al tracto gastrointestinal, desde las glándulas salivares o con la bilis, en este caso también cuando el antibiótico se administra por vía parenteral.

En general, la administración de amoxicilina con ácido clavulánico favorece la colonización del tracto gastrointestinal por enterobacterias resistentes a la amoxicilina (2) o a la asociación y por levaduras (3). Con anterioridad se había descrito la colonización intestinal con levaduras hasta en un 50% de los pacientes tratados con esta asociación durante diez días (4). En el caso de piperacilina-tazobactam se observa una reducción de anaerobios, enterobacterias y enterococos, aunque esta alteración no se asoció al sobrecrecimiento de otros microorganismos en el estudio realizado por Nord y cols. (5). En el caso de sulbactam-ampicilina se ha observado una reducción de la microflora anaerobia y aerobia tanto en intestino como en el tracto respiratorio superior, con sobrecrecimiento de levaduras y algún bacilo gramnegativo (6, 7).

En muchas ocasiones no se aísla ningún microorganismo como causa de la diarrea. Parece que este efecto adverso tiene que ver con una disminución en la producción de ácidos grasos de cadena corta, debido a una reducción de los procesos de fermentación, con acumulación de carbohidratos, que ejercen un efecto osmótico impidiendo la absorción de agua (8).

Para que aparezca tal alteración en la flora intestinal es necesario el tratamiento con estos antibióticos durante un tiempo, al menos cuatro días. En cambio, se ha observado que en algunos casos los pacientes presentan alteraciones gastrointestinales en las primeras horas tras la administración de amoxicilina-ácido clavulánico, tanto por vía oral como parenteral. Incluso pueden aparecer de forma inmediata, durante la administración intravenosa de la asociación, que mejora al diluir más el preparado y administrarlo más lentamente.

Una posible explicación puede estar relacionada con las alteraciones de la motilidad gastrointestinal observadas tras la administración de amoxicilina-ácido clavulánico. Se estudió este efecto midiendo por manometría la motilidad en el duodeno y el yeyuno (9), observándose un incremento de la motilidad nocturna a este nivel, tanto en duración como en amplitud de las contracciones que propelen el contenido intestinal a larga distancia, conocidas como fase III dentro de la secuencia de procesos del tránsito gastrointestinal. No se conoce el mecanismo por el que esto ocurre, y tampoco se estudió este mismo efecto utilizando únicamente amoxicilina, por lo que la imputabilidad de este hecho a uno de los dos componentes de la asociación no se ha aclarado. Con anterioridad se había observado un efecto procinético con eritromicina y otros macrólidos, estimulantes de la motilidad en el estómago y el duodeno (10, 11).

Aunque la incidencia de colitis pseudomembranosa durante el curso del tratamiento con betalactámicos asociados a inhibidores de betalactamasas es muy baja, parece importante hacer un comentario al respecto, dada la gravedad del cuadro. En el caso de antibióticos administrados por vía oral, relacionados en mayor medida con el desarrollo de esta complicación, la asociación amoxicilina-ácido clavulánico se encuentra en el grupo de los fármacos implicados con mayor frecuencia, junto a la cefixima. En cualquier caso, en la población general se observan 2,3 casos de colitis pseudomembranosa por cada 100.000 prescripciones (12), aunque se ha identificado Clostridium difficile en el 13% de los niños tratados con amoxicilina-ácido clavulánico durante más de seis días, independientemente de que desarrollen diarrea o no (13).

A pesar de todo lo comentado hasta ahora, la incidencia de efectos adversos gastrointestinales no es superior a la observada durante el tratamiento con otros antibióticos, dado que existen ensayos clínicos comparativos que así lo corroboran (7, 14, 15). Estas comparaciones se han realizado entre amoxicilina-ácido clavulánico y diversos macrólidos (claritromicina, azitromicina, diritromicina) y otros betalactámicos (cefalosporinas, amoxicilina), entre piperacilina-tazobactam y carbapenémicos o la asociación clindamicina y gentamicina, y entre sulbactam-ampicilina y otros betalactámicos (cefalosporinas, aminobencilpenicilinas).

Bibliografía

1. Martínez-Mir, I., Ferrer, J.M., Palop, V., Estañ, L., Rubio, E., Morales-Olivas, F.J. Are the adverse drug reactions of amoxycillin and amoxycillin-clavulanic acid similar? Pharmacoepidemiol Drug Saf 1996; 5: 247-254.
2. Lambert-Zechovsky, N., Bingen, E., Proux, M.C., Aujard, Y., Mathieu, H. Influence de l'amoxicilline associée a l'acide clavulanique sur la flore fecale de l'enfant. Path Biol 1984; 32: 436-438.
3. Todd, P.A., Benfield, P. Amoxicillin/clavulanic acid. An update of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use. Drugs 1990; 39: 264-307.
4. Vlaspolder, F., Zeeuw, G., Pozenberg-Arska, M., Egyedi, P., Verhoef, J. The influence of flucoxacillin and amoxicillin with clavulanic acid on the aerobic flora of the alimentary tract. Infection 1987; 15: 241-244.
5. Nord, C.E., Brismar, B., Kasholm-Tengve, B., Tunevall, G. Effect of piperacillin/tazobactam treatment on human bowell microflora. J Antimicrob Chemother 1993; 31 (Suppl. A): 61-65.
6. Campoli-Richards, D., Brogden, R.N. Sulbactam/ampicillin. A review of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties, and therapeutic use. Drugs 1987; 33: 577-609.
7. Friedel, H.A., Campoli-Richards, D., Goa, K.L. Sultamicillin. A review of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use. Drugs 1989; 37: 491-522.
8. Clausen, M.R., Bonnen, H., Tvede, M., Mortensen, P.B. Colonic fermentation to short-chain fatty acids is decreased in antibiotic-associated diarrhea. Gastroenterology 1991; 101: 1497-1504.
9. Caron, F., Ducrotte, P., Lerebours, E., Colin, R., Humbert, G., Denis, P. Effects of amoxicillin-clavulanate combination on the motility of the small intestine in human beings. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 1085-1088.
10. Pilot, M.A. Macrolides in roles beyond antibiotic therapy. Br J Surg 1994; 61: 1423-1429.
11. Peeters, T.L., Depoortere, I. Motilin receptor: A model for development of prokinetics. Dig Dis Sci 1994; 39 (Suppl. 12): 76S-78S.
12. Carbon, C., Richard, A., Bons, B. Les colites pseudo-membraneuses associées a l'antibiotherapie. Resultats d'une enquête auprès de 900 gastroentérologues. Therapie 1994; 49: 325-331.
13. Mitchell, D.K., Van, R., Mason, E.H., Norris, D.M., Pickering, L.K. Prospective study of toxigenic Clostridium difficile in children given amoxicillin/clavulanate for otitis media. Pediatr Infect Dis J 1996; 15: 514-519.
14. Sterkers, O. Efficacy and tolerability of ceftibuten versus amoxicillin/clavulanate in the treatment of acute sinusitis. Chemotherapy 1997; 43: 352-357.
15. Craft, J.C., Siepman, N. Overview of the safety profile of clarithromycin suspension in pediatric patients. Pediatr Infect Dis J 1993; 12 (Suppl. 3): S142-S147

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Inhibidores de betalactamasas en el género Haemophilus

M.C. Rodríguez-Avial López-Dóriga

Servicio de Microbiología, Hospital Clínico Universitario, Madrid.

Haemophilus influenzae produce importantes infecciones sistémicas, especialmente cuando presenta cápsula del serotipo b (Hib). Afortunadamente las meningitis y epiglotitis por Hib son poco frecuentes en nuestro medio. Sin embargo, sí está documentado el papel preponderante de aislamientos, fundamentalmente sin cápsula, en las infecciones respiratorias de nuestra comunidad, junto a otras especies bacterianas como Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis.

Además de por su frecuencia, H. influenzae tiene un gran interés por el constante desarrollo de resistencia a diversos tipos de antimicrobianos, entre los que se incluyen los betalactámicos. La resistencia a éstos se debe a diferentes mecanismos. El mecanismo de resistencia que aparece en primer lugar, en 1974, es la producción de una betalactamasa (1, 2), y desde entonces es la forma mas frecuente de resistencia a la ampicilina en todo el mundo (3-5). Como resultado de la búsqueda de inhibidores de betalactamasas se introduce en 1981 la asociación amoxicilina-ácido clavulánico (6), que resolvió este mecanismo de resistencia. Pero en esta misma década comienzan a publicarse aislamientos de H. influenzae resistentes a la ampicilina que no producen betalactamasas (7-10), debido fundamentalmente a una alteración en las PBP (11-14), aunque puede estar también implicada una alteración en la permeabilidad (13, 15). Estos aislamientos con resistencia intrínseca no son fáciles de detectar porque rara vez requieren mas de 4 µg/ml para su inhibición (16).

Los aislamientos con resistencia intrínseca tienen una reducción variable en su sensibilidad a otros betalactámicos; así, frente a amoxicilina-ácido clavulánico presentan una CMI dos o más de dos diluciones al doble sobre la CMI modal (16). La relevancia clínica de esta disminución, al igual que ocurre con otros betalactámicos, no está clara, pero desde un punto de vista conservador se puede asumir que todas las cepas con resistencia intrínseca son resistentes a los otros betalactámicos (17, 18).

Por otra parte, la combinación entre amoxicilina y ácido clavulánico viene ensayándose en la proporción 2:1, pero nosotros estudiamos el impacto que un eventual cambio en esta proporción tendría sobre H. influenzae, encontrando que las CMI obtenidas con las proporciones 2:1, 3:1 y 4:1 prácticamente no se alteran (19). Encontramos además tres cepas que requerían CMI de amoxicilina-ácido clavulánico de 8 µg/ml y que por tanto se deben considerar resistentes, dos de las cuales eran productoras de betalactamasas. En 1997 Doern y cols. (5), en un estudio multicéntrico en EE.UU., encuentran 17 cepas betalactamasa positivas y resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico. Las posibles explicaciones de este fenotipo incluyen: hiperproducción de betalactamasas TEM-1 o ROB-1, producción de una TEM-1 o ROB-1 alterada y por ello resistente a la acción del ácido clavulánico, producción de una nueva betalactamasa resistente a la acción de este inhibidor y, finalmente, un mecanismo mixto de alteración de PBP además de producción de betalactamasa (TEM-1 o ROB-1). Esto indica que tales cepas requieren para su inhibición concentraciones superiores de todos los betalactámicos, excepto cefixima y cefpodoxima.

La segunda posibilidad mencionada en el párrafo anterior, la producción de una betalactamasa tipo TEM-1 resistente a la inhibición, es decir, un derivado de TEM-1 por mutación, que se viene denominando IRT (inhibitor resistant TEM), es un mecanismo de especial interés pues representa una adaptación específica para resistir a los inhibidores de betalactamasas. Ya han sido aisladas Escherichia coli productoras de IRT (20) y, a diferencia de las betalactamasas de espectro ampliado, están ampliamente distribuidas en las infecciones extrahospitalarias (21). ¿Cómo no se han encontrado aún en H. influenzae? Nicolas-Chanoine (22) considera que se puede deber a una mayor actividad intrínseca de las penicilinas frente a estos aislamientos o a un número inadecuado de bacterias en el reservorio humano, la nasofaringe, para que tenga lugar la mutación puntual espontánea en el gen plasmídico que codifica la betalactamasa tipo TEM.

Bibliografía

1. Khan, W., Ross, S., Rodríguez, W., Controni, G., Saz, A.K. Haemophilus influenzae type b resistant to ampicillin. J Am Med Asoc 1974; 229: 298-301.
2. Williams, J.D., Kattan, S., Savanagh, P. Penicilinase production by Haemophilus influenzae. Lancet 1974; 2: 103.
3. Kayser, F.H., Morenzoni, G., Santanam, P. The Second European Collaborative study on the frecuency of antimicrobal resistance in Haemophilus influenzae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9: 810-817.
4. Perea, E.J., García, M.C., Clavijo, M.J. y cols. Resistencias en Haemophilus influenzae en España. Segundo Estudio (1990). Enferm Infecc Microbiol Clin 1993; 11: 19-28.
5. Doern, G.V., Brueggemann, A.B., Pierce, G. y cols. Antibiotic resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae in the Unites States in 1994 and 1995 and detection of betalactamase-positive strains resistant to amoxicillin-clavulanate: Results of a National Multicenter Surveillance Study. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 292-297.
6. Brown, A.G., Butterworth, D., Cole, M. y cols. Naturally-ocurring ß-lactamase inhibitors with antibacterial activity. J Antibiot 1976; 29: 668-669.
7. Bell, S.M., Plowman, D. Mechanisms of ampicillin resistance in Haemophilus influenzae from respiratory tract. Lancet 1980; 1: 279-280.
8. Markowitz, S.M. Isolation of an ampicillin-resistant, non ß-lactamase producing strain of Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother 1980; 17: 80-83.
9. Offit, P.A., Campos, J.M., Plotkin, S.A. Ampicillin-resistant ß-lactamase negative Haemophilus influenzae type b. Pediatrics 1982; 69: 230-231.
10. Rodríguez-Avial, C., Martínez Redondo, P., López Bartolomé, O. y cols. Cepas de Haemophilus influenzae resistentes a ampicilina y no productoras de betalactamasa. Infectológika 1984; 4: 11-17.
11. Malouin, F., Bryan, L.E. Modification of penicillin-binding-proteins as mechanisms of ß-lactam resistance. Antimicrob Agents Chemother 1986; 30: 1-5.
12. Parr, T.R., Bryan, L.E. Mechanism of resistance of an ampicillin-resistant, ß-lactamase negative clinical isolate of Haemophilus influenzae type b to ß-lactam-antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 1984; 25: 747-753.
13. Mendelman, P.M., Chaffin, D.O., Stull, T.L. y cols. Characterization of non ß-lactamases mediated ampicillin resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother 1984; 26: 235-244.
14. Mendelman, P.M., Chaffin, D.O., Musser, J.M. y cols. Genetic and phenotypic diversity among ampicillin-resistant, non ß-lactamase producing nontypeable, Haemophilus influenzae isolates. Infect Immun 1987; 55: 2585-2589.
15. Burns, J.L., Smith, A.L. A major outer-membrane protein functions as a porin in Haemophilus influenzae. J Gen Microbiol 1987; 133: 1273-1277.
16. Powell, M. Antimicrobial resistance Haemophilus influenzae. J Med Microbiol 1988; 27: 81-87.
17. Barry, A.L., Fuchs, P.C., Pfaller, M.A. Susceptibilities of ß-lactamase-producing and non-producing ampicillin resistant strains of Haemophilus influenzae to ceftibuten, cefaclor, cefuroxime, cefixime, cefotaxime and amoxicillin-clavulanic acid. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 14-18.
18. Yeo, S.F., Chiev, Y.J., Fung, C.P. Susceptibility of Haemophilus influenzae isolates with known resistance mechanisms to five cephalosporins. Chemotherapy 1996; 42: 85-89.
19. Picazo, J.J., Rodríguez-Avial, C. Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis frente a los antimicrobianos de administración oral. Enferm Infecc Microbiol Clin 1993; 11 (Supl. 1): 10-14.
20. Knox, J.R. Extended-spectrum and inhibitor-resistant TEM-type ß-lactamases: Mutation, specificity and three-dimensional structure. Ant Agents Chemother 1995; 39: 2593-2601.
21. Henquell, C., Sirot, D., Chanal, C. y cols. Frecuency of inhibitor-resistant TEM ß-lactamases in Escherichia coli isolates from urinary tract infections in France. J Antimicrob Chemother 1994; 34: 707-714.
22. Nicolas-Chanoine, M.H. Inhibitor-resistant ß-lactamases. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 1-3.

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Inhibidores de betalactamasas en Streptococcus pneumoniae

M.L. Gómez-Lus1, L. Aguilar2, M.J. Giménez2 y J. Prieto1

1Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid; 2Departamento Médico, SmithKline Beecham S.A., Madrid

tamiento de elección durante muchos años, pero desde los años 1970 han aparecido cepas con diferente grado de resistencia. La resistencia a la penicilina aparece como consecuencia de las mutaciones en los genes que codifican las PBP (proteínas fijadoras de penicilina), que producen una afinidad de fijación disminuida, alterándose las PBP1a, 2x y 2b no solamente a la penicilina sino a otros betalactámicos.

Tras producirse las mutaciones, la concentración mínima inhibitoria (CMI) se incrementa. Se define como resistencia intermedia cuando la CMI es de 0,1-1 µg/ml y la resistencia de alto grado si la CMI es ³ 2 µg/ml. En España es progresivo el aumento de cepas de S. pneumoniae multirresistentes, por lo que es importante seleccionar antimicrobianos que puedan ser eficaces en este tipo de infecciones.

Pese a que existe una afinidad reducida a otros betalactámicos y que no se ha detectado la producción de betalactamasas en S. pneumoniae, la amoxicilina y la amoxicilina-ácido clavulánico han mostrado su eficacia en el tratamiento de las infecciones respiratorias y la otitis media (1-3); además, las cepas aisladas en esputos y exudados óticos son más resistentes a la penicilina.

Según el NCCLS se consideran los siguientes valores para determinar la actividad antimicrobiana de amoxicilina-ácido clavulánico: sensible £0,5-0,25, resistencia intermedia 1-0,5, resistencia elevada ³2-1. Pese a que se consideraba que el ácido clavulánico no tenía actividad antibacteriana demostrable mediante los parámetros clásicos de valoración, Severin ha observado que se fija selectivamente a la PBP3, produciendo una lisis prematura e hipersensibilidad a la lisozima (4), así que produce alteraciones en la estructura del peptidoglicano de la pared; destaca además la reducción de la CMI de penicilina tanto en la cepa sensible como en la resistente, hecho que ya había observado años antes Greenwood (5).

Mediante curvas de letalidad bacteriana con las concentraciones alcanzadas en suero tras las dosis habituales de amoxicilina y amoxicilina-ácido clavulánico se comprobó que con concentraciones suprainhibitorias y transcurridas tres horas de incubación se produjo la misma reducción del inóculo. Es de destacar que frente a la cepa resistente el ácido clavulánico aumentó la capacidad de reducción inicial (35%), por lo que se incrementa la velocidad bactericida (6). Así, la lisis prematura producida por la unión del ácido clavulánico a la PBP produciría un aumento de la velocidad bactericida.

Por otra parte, Severin apuntaba que el ácido clavulánico hacía que S. pneumoniae fuera más vulnerable a la lisozima, y es importante recordar que los fagocitos tienen una elevada concentración de lisozima, por lo que sería importante en la función del ácido clavulánico como inmunomodulador.

En este sentido se observa un sinergismo entre el ácido clavulánico y los polimorfonucleares (PMN) frente a cepas resistentes a penicilina debido a las alteraciones que provocó el antimicrobiano sobre las bacterias, como modificaciones de la estructura de la pared bacteriana, producción de filamentación, disminución de la velocidad de crecimiento, etc. (7).

Así, al estudiar el efecto del ácido clavulánico con PMN y suero, y midiendo la muerte intra y extracelular tras una hora de incubación, se produjo una reducción del inóculo mayor del 50% a concentraciones de 1-4 µg/ml, mientras que el suero más PMN o el ácido clavulánico más suero no producen reducción del inóculo. Esto puede aparecer tras la alteración de la morfología de la pared celular que puede afectar a la fagocitosis; la muerte intrafagocítica aparecería por la acción de la lisozima, cuya función se potenciaría por la sensibilización posterior a la destrucción de la pared por el ácido clavulánico (8).

Por todo lo comentado, la asociación amoxicilina-ácido clavuánico es uno de los antimicrobianos más eficaces en el tratamiento de la otitis media y las infecciones de las vías respiratorias adquiridas en la comunidad causadas por cepas de S. pneumoniae con diferente grado de sensibilidad a la penicilina, ya que además esta asociación también es eficaz frente a otros patógenos respiratorios productores de betalactamasas, como Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis (9).

Bibliografía

1. Hoberman, A., Paradise, J.L., Block, S., Burch, D.J., Jacobs, M.R., Balanescu, M.I. Efficacy of amoxicillin/clavulanate potassium for acute otitis media: Relation to Streptococcus pneumoniae susceptibility. Pediatr Infect Dis J 1996; 15: 955-962.
2. Smith, G.M., Slocombe, B., Abbott, K.H., Mizon, L.W. Activity of amoxixillin-clavulanate against penicillin resistant Streptococcus pneumoniae in a experimental respiratory infection model in rats. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42 (4): 813-817.
3. Kaplan, S.L., Mason, E.O. Management of infections due to antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae. Clin Microbiol Rev 1998; 11 (4): 628-644.
4. Severin, A., Severina, E., Tomasz, A. Abnormal physiological properties and altered cell wall composition in Streptococcus pneumoniae grown in the presence of clavulanic acid. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41(3): 504-510.
5. Greenwood, D. A type of interaction between clavulanic acid and other ß-lactam antibiotic distinct from the ß-lactamase inhibition effect. En: Rolinson, G.N., Watson, A. (Eds.). Augmentin clavulanate potentiated amoxycillin. 1st Symposium, July 1980. Excerpta Medica, Amsterdam 1980; 80-83.
6. Martín, A., Gómez-Lus, M.L., Aguilar, L., Martínez, P., Giménez, M.J., Prieto, J. Effect of clavulanic and a polymorphonuclear neutrophils on amoxicillin bactericidal activity againts Streptococcus pneumoniae. Eur J Clin Microbial Infect Dis 1997; 16: 512-516.
7. Gómez-Lus, M.L., Aguilar, L., Martín, M., Giménez, M.J., Martínez, P., Prieto, J. Intracellular killing of a penicillin resistant, serotype 9 strain of Streptococcus pneumoniae by polymorphonuclear leucocytes in the presence of subinhibitory concentrations of clavulanic acid. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 112-144.
8. Prieto, J., Frías, J., Alou, L., Carcas, A. Estudio de la actividad bactericida de la combinación amoxicilina/clavulánico y sus posibles efectos ante la resistencia a betalactámicos de Streptococcus pneumoniae. Med Clin 1998; 110 (Supl. 1) 12-15.
9. Thorburn, C.E., Knott, S.J., Edwards, D. In vitro activities of oral ß-lactams at concentrations achieved in humans againts penicillin susceptible and resistant pneumococci and potential to select resistance. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42 (8): 1973-1979.

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Actividad de los inhibidores de betalactamasas frente a Acinetobacter baumannii

F. Fernández Cuenca

Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Virgen Macarena, Facultad de Medicina, Sevilla.

El mecanismo de resistencia a los betalactámicos más estudiado en Acinetobacter baumannii es la producción de betalactamasas, tanto plasmídicas como cromosómicas. Las cefalosporinas cromosómicas descritas en A. baumannii, a pesar de pertenecer al grupo 1 de la clasificación de Bush, constituyen un grupo de enzimas heterogéneo desde el punto de vista funcional. Las betalactamasas plasmídicas detectadas en A. baumannii pertenecen todas a la clase A, incluyendo TEM-1, TEM-2, CARB-5, OXA-21, ARI-1, ARI-2, AbRC-1, así como betalactamasas de espectro extendido de tipo TEM, SHV y OXA que aún no están bien caracterizadas.

El inhibidor de betalactamasas mejor estudiado en A. baumannii es el sulbactam, seguido del tazobactam, el ácido clavulánico y, en menor medida, BRL 42715.

El sulbactam es el inhibidor de betalactamasas que tiene in vitro mayor actividad intrínseca frente a A. baumannii debido a su afinidad por la PBP2 (1). De hecho, su actividad es superior a la de las penicilinas de amplio espectro y las cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación. Estudios recientes in vitro demuestran que el sulbactam solo es igual de activo (CMI50 2 mg/l) que en combinación con ampicilina, ticarcilina o ticarcilina-ácido clavulánico. Sin embargo, la CMI del sulbactam, solo o asociado con ampicilina, frente a cepas de A. baumannii multirresistentes con CMI de imipenem ³8 mg/l varía entre £4 mg/l, y ³32 mg/l (2, 3). Los resultados de los estudios realizados in vitro sobre la actividad bactericida del sulbactam son también discrepantes. Todo ello podría sugerir que en estas cepas existen mecanismos de resistencia a los betalactámicos distintos a la producción de betalactamasas (alteraciones en la permeabilidad de la membrana externa, modificaciones en las PBP, etc.).

El sulbactam inactiva principalmente las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado y en menor medida las de espectro extendido, aunque su actividad inhibidora es mucho menor que la del ácido clavulánico. Sobre las cefalosporinasas cromosómicas dicha actividad es variable, quizás debido a la heterogeneidad funcional de éstas.

El tazobactam también tiene actividad intrínseca frente a A. baumannii, pero este inhibidor de betalactamasas es menos activo que el sulbactam y, a diferencia de éste, posee mayor actividad inhibidora de betalactamasas plasmídicas. La actividad inhibidora del ácido clavulánico es similar a la del tazobactam.

El ácido clavulánico y BRL 42715, a pesar de ser muy activos frente a las betalactamasas plasmídicas, no poseen prácticamente actividad intrínseca frente a A. baumannii. BRL 42715 es, además, un potente inhibidor de betalactamasas cromosómicas. Aunque BRL 42715 posee mayor actividad inhibidora que el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam, su actividad frente a A. baumannii no está aún bien caracterizada. La asociación de BRL 42715 con ampicilina o imipenem disminuye la CMI90 16 y 64 veces, respectivamente (4).

Dentro de las combinaciones clásicas entre inhibidor de betalactamasas y betalactámico, la que presenta mayor actividad intrínseca tanto in vitro como in vivo es la asociación de ampicilina y sulbactam, debido a la actividad antibacteriana del sulbactam y a que las concentraciones de éste alcanzadas en sangre son superiores a las del ácido clavulánico y el tazobactam.

En un modelo de infección intraperitoneal por A. baumannii se ha demostrado que el sulbactam es más activo que el tazobactam (DE50 de 1,62 y 16,7 mg/kg, respectivamente), obteniéndose tasas de supervivencia del 100% con sulbactam y el 50% con tazobactam (5).

Los resultados obtenidos con la asociación de ticarcilina, ácido clavulánico y sulbactam en un modelo de neumonía murina por A. baumannii productor de cefalosporinasas (CMI de ticarcilina, imipenem y sulbactam de 32, 0,5 y 0,5 mg/l, respectivamente) sugieren la utilidad de esta combinación en el tratamiento de la neumonía por A. baumannii (6).

Algunos estudios demuestran que las asociaciones de carbapenémicos con sulbactam son muy activas in vitro, ejerciendo un elevado poder bactericida; en otros estudios, sin embargo, no se ha observado este efecto (3, 7). Otras asociaciones que han mostrado tener efecto bactericida in vitro son sulbactam más ceftazidima, cefepima o cefpiroma (3).

La experiencia clínica con inhibidores de betalactamasas en el tratamiento de las infecciones por A. baumannii es limitada. No obstante, la asociación más utilizada ha sido ampicilina (2 g) más sulbactam (1 g), con la que se han obtenido tasas de curación que oscilan entre el 50% y el 75% (2, 8).

Bibliografía

1. Labia, R., Morand, A., Lelievre, V., Mattioni, D., Kazmierczak, A. Sulbactam: Biochemical factors involved in its sinergy with ampicillin. Rev Infect Dis 1986; 8 (Suppl. 5): S496-S502.
2. Urban, C., Go, E., Mariano, N. y cols. Effect of sulbactam on infections caused by imipenem-resistant Acinetobacter calcoaceticus biotype anitratus. J Infect Dis 1993; 167: 448-451.
3. Aubert, G., Guichard, D., Vedel, G. In vitro activity of cephalosporins alone and combined with sulbactam against various strains of Acinetobacter baumannii with different antibiotic resistance profiles. J Antimicrob Chemother 1996; 37: 155-160.
4. Rodríguez, G., Martínez-Martínez, L., Pascual, A., Perea, E.J. Actividad de betalactámicos e inhibidores de betalactamasas frente a cepas clínicas de Acinetobacter baumannii. Rev Esp Quimioter 1996; 9: 193.
5. Obana, Y., Nishimo, T. In vitro and in vivo activities of sulbactam and YTR830H against Acinetobacter calcoaceticus. J Antimicrob Chemother 1990; 26: 677-682.
6. Wolff, M., Joly-Guillou, M.L., Carbon, C. In vivo efficacy of ß-lactamase inhibitors (BLI) alone and in combination against A. baumannii (Ab) in a mouse pneumonia model. 36th Interscience Congress Antimicrobial Agents Chemotherapy, Toronto 1996; B61.
7. Joly-Guillou, M.L., Decré, D., Herrman, J.L., Bourdelier, E., Bergogne-Bérézin, E. Bactericidal in vitro activity of ß-lactams and ß-lactamase inhibitors, alone or associated, against clinical strains of Acinetobacter baumannii bactericidal effect of combination with aminoglycosides. J Antimicrob Chemother 1995; 36: 619-629.
8. Jiménez-Mejías, M.E., Pachón, J., Becerril, B. y cols. Treatment of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii meningitis with ampicillin/sulbactam. Clin Infect Dis 1997; 24: 932-935.

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Betalactámicos-inhibidores de betalactamasas en Mycobacterium

J.C. Galán

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

Epidemiología

Desde 1953 a 1985 el número de casos de tuberculosis comunicados disminuyó con un promedio anual del 5,8%. Sin embargo, esta tendencia se invierte en 1985, con un incremento del 20% por cada 100.000 habitantes. En un periodo muy corto las cifras se convierten en alarmantes. Simultáneamente, la aparición de cepas resistentes es cada vez más frecuente y se describen dramáticamente los primeros brotes de tuberculosis multirresistente (con una mortalidad próxima al 70%), lo que supone recurrir a fármacos de segunda línea, que por su toxicidad habían sido excluidos (capreomicina, tiacetazona). Esta situación hace que en 1993 la OMS declare, en una actuación sin precedentes, a la tuberculosis como una emergencia sanitaria mundial.

Se ensayan otros regímenes terapéuticos, como las nuevas fluoroquinolonas (ofloxacino y las más modernas como moxifloxacino y esparfloxacino), ésteres y derivados de la pirazinamida, derivados imidazólicos y antibióticos betalactámicos, entre otros.

La idea de emplear betalactámicos para el tratamiento de la tuberculosis se ha visto siempre como poco acertada. La experiencia clínica esta repleta de ejemplos de pacientes que recibieron betalactámicos para el tratamiento de una supuesta neumonía bacteriana, cuya situación no mejoró y posteriormente se demostró que tenían tuberculosis. Sin embargo, algunas notas pueden sugerirnos que los antibióticos betalactámicos pueden formar parte de los regímenes antituberculosos:

1) El grado de penetración de los antibióticos betalactámicos a través de la membrana celular de las micobacterias es baja (comparado con el de Escherichia coli), y el equilibrio a ambos lados de la membrana tarda unos minutos en alcanzarse, pero como el tiempo de generación para Mycobacterium tuberculosis es de 18 a 24 horas, es suficiente para alcanzar concentraciones inhibitorias.

2) Desde el punto de vista bioquímico los betalactámicos presentan afinidad por las PBP de las micobacterias a unas concentraciones que son alcanzables con las dosis terapéuticas habituales.

Betalactámicos En Tuberculosis

Antecedentes

Los antibióticos betalactámicos resultan ineficaces para el tratamiento de la tuberculosis y de casi todas las micobacteriosis, con CMI >128 µg/ml.

En 1966, Kasik trata con bencilpenicilina, bencilpenicilina más dicloxacilina y suero fisiológico a ratones con tuberculosis. La vida media de los animales control fue de 30 días, incrementándose en los tratados con bencilpenicilina más dicloxacilina. En 1987-1988 Casal, Sorg y Wong demuestran que la administración conjunta de un betalactámico y un inhibidor de betalactamasas reduce la CMI más de ocho veces. Estos resultados han sido repetidos por otros muchos investigadores en años sucesivos: Zhang en 1992, Chambers en 1995 o Segura en 1998, entre otros. En todos los casos el ácido clavulánico resulta ser el más potente inhibidor.

Resistencias A Los betaLactámicos En Micobactrerias

La resistencia a los antibióticos betalactámicos en micobacterias, como en la mayoría de las bacterias, depende de uno o más de estos factores:.

– Impermeabilidad: en M. chelonae, la baja permeabilidad (10 veces menor que en M. tuberculosis e igual que en Pseudomonas aeruginosa) a los betalactámicos parece ser el factor crítico en la resistencia.

– Alteración de las PBP: M. smegmatis presenta resistencia por disminución de la afinidad por la PBP1. Mutantes en M. fortuitum tratado con cefoxitina presentan disminución de afinidad en todas las PBP.

– Presencia de betalactamasas: en M. fortuitum, M. tuberculosis y M. smegmatis se han descrito betalactamasas. M. gastri y M. kansasii hidrolizan la nitrocefina, pero no se ha identificado ninguna betalactamasa.

Betalactamasas en M. tuberculosis

Existe cierta controversia en determinar las betalactamasas que tiene M. tuberculosis (si es que tiene más de una). Existe una betalactamasa identificada por Chambers en 1997, denominada BlaA, con actividad predominantemente penicilinasa.

La disponibilidad de la secuencia del genoma de M. tuberculosis ha permitido encontrar ORF que muestran alguna homología con betalactamasas de clase A y de clase C. Además, existen evidencias indirectas de su existencia: Kishan comunica la detección de una enzima con actividad cefalosporinasa, con pI 4,5, que presenta un perfil de sustrato distinto a la betalactamasa principal, BlaA; Chambers encuentra hibridación positiva con una sonda de ampC sobre DNA total de M. tuberculosis.

Estudios con BlaA de M. Tuberculosis

En 1997 el grupo de Chambers clonó y secuenció la única betalactamasa descrita hasta la fecha. Se trata de una betalactamasa de clase A, perteneciente al grupo 2b (betalactamasas inhibibles por ácido clavulánico), de acuerdo con la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros.

Es una penicilinasa con pI 4,9-5,1, causante de más del 80% de la actividad betalactamasa. Es una exoenzima de expresión constitutiva, pues su producción no es inducible en presencia de betalactámicos ni se ha descrito ningun regulador similar a los que aparecen en betalactamasas homólogas (como BlaR en B. liqueniformis).

Presenta los cuatro dominios propios de betalactamasas de clase A, con la peculiaridad del motivo SDG, sólo descrito previamente en la betalactamasa de S. clavuligerus.

No confiere resistencia cuando se transforma en E. coli.

Actividad De Los Inhibidores De Betalactamasasen En Pacientes Con Tuberculosis

Hasta ahora, los pocos casos de pacientes tratados con amoxicilina-ácido clavulánico (2:1) eran simultáneamente tratados con otros fármacos antituberculosos, lo que hacía difícilmente valorable el efecto del betalactámico más el inhibidor de betalactamasas. Chambers realiza el primer estudio en pacientes con tuberculosis tratados en monoterapia con amoxicilina-ácido clavulánico durante siete días, observando una reducción de cinco veces en el número de bacilos viables, pero toda la reducción ocurre en los tres primeros días de tratamiento; es lo que él denomina "efecto plateau". Es la primera vez que los betalactámicos han demostrado ser útiles frente a la tuberculosis en un ensayo clínico, resultando por ello de especial interés conocer los mecanismos de resistencia a la asociación de betalactámico más inhibidor de betalactamasas.

Si la betalactamasa resulta ser el mecanismo fundamental de la resistencia a los betalactámicos en M. tuberculosis, será de gran utilidad la identificación y caracterización de mutaciones implicadas en la resistencia a los inhibidores, cuyo conocimiento nos permitirá desarrollar nuevas moléculas activas frente a esos mutantes.

Bibliografía

1. Tuberculosis Programme, World Health Organization. Tuberculosis Notification Uptake, December 1993. Genova, Switzerland: WHO/TB/94.175.
2. Jarlier, V., Nikaido, H. FEMS Microbiol Lett 1994; 123: 11-18.
3. Chambers, H., Moreau, D., Yajko, D. y cols. Can penicillins and other ß-lactam antibiotics be used to treat tuberculosis? Antimicrob Agents Chemother 1995; 39 (12): 2620-2624.
4. Nadler, J., Berger, J., Nord, J. y cols. Amoxicilin-clavulanic acid for treating drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Chest 1991; 99: 1025-1026.
5. Yew, W., Wong, C., Lee, J., Chau, C. Do ß-lactam-ß-lactamase inhibitor combinations have a place in the treatment of multidrug-resistant pulmonary tuberculosis? Tubercle Lung Disease 1995; 76: 90-92.
6. Hackbarth, C., Unsal, I., Chambers, H. Cloning and sequence analysis of a class A ß-lactamase from Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41 (5): 1182-1185.
7. Kishan, R., Voladri, D., Lakey, D. y cols. Recombinant expression and characterization of the major ß-lactamase of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42 (6): 1375-1381.
8. Chambers, H., Kocagöz, T., Sipit, T., Turner, J., Hopewell, P. Activity of amoxicilin/clavulanate in patients with tuberculosis. Clin Inf Dis 1998; 26: 874-877.

índice

• Bases moleculares de la evolución de las betalactamasas plasmídicas de tipo TEM
• Epidemiología de las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado
• Novedades en la relación entre inhibidores de betalactamasas y betalactámicos
• Cefalosporinas inducibles: de AmpC a las cefamicinasas plasmídicas
• Carbapenemasas.¿Un nuevo reto para la antibioterapia
• Aspectos metodológicos del estudio de las betalactamasas: del fenotipo al genotipo

Bases moleculares de la evolución de la betalactamasas plasmídicas de tipo TEM.

Las betalactamasas de tipo TEM, incluidas en los grupos 2b, 2be y 2br de la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros (1), constituyen un grupo de enzimas que pertenecen a la clase molecular A. Estas betalactamasas han alcanzado un gran éxito evolutivo y se encuentran ampliamente difundidas entre las bacterias gramnegativas, en parte, probablemente, por su codificación plasmídica y la inclusión del determinante genético en el seno de un transposón. En algunas especies, como Escherichia coli, del 30% al 50% de los aislamientos clínicos poseen una betalactamasa de tipo TEM. En la actualidad hay descritos más de 40 tipos diferentes de TEM, lo que representa el 20% de todas las betalactamasas conocidas.

Aunque el origen de estas enzimas permanece oscuro, la evolución y diseminación de las betalactamasas plasmídicas de tipo TEM parecen ser la consecuencia directa de la evolución y el consumo de antibióticos betalactámicos. Los primeros betalactámicos (penicilinas, amino, carboxi y ureidopenicilinas, y las cefalosporinas de primera generación) seleccionaron bacterias portadoras de betalactamasas plasmídicas de tipo TEM originales (TEM-1 y TEM-2). En 1963 se identifica por vez primera una betalactamasa de tipo TEM, la TEM-1, en una cepa clínica aislada en Grecia (2). En 1969 se identifica la TEM-2 (3) y durante los 15 años siguientes no se encuentran nuevas TEM. El aumento en el consumo de betalactámicos originó la diseminación (diferentes plásmidos portadores, en diferentes cepas de la misma especie, en diferentes especies) de los genes que codificaban estas betalactamasas. Tras unos años, las betalactamasas de tipo TEM se hallaban ampliamente diseminadas en bacterias gramnegativas de interés clínico.

Después, en un periodo de tiempo relativamente corto (1978 a 1986) fueron desarrollados nuevos betalactámicos, como las cefalosporinas de tercera generación, los monobactames y los inhibidores suicidas. Las enzimas TEM-1 y TEM-2 eran incapaces de hidrolizar estos nuevos sustratos. Las TEM estaban ampliamente diseminadas y el resultado no se hizo esperar. Empezaron a aparecer bacterias que, al producir estas betalactamasas, eran resistentes a los nuevos antibióticos betalactámicos. En 1984 se describe la TEM-3 (4), una variante de TEM-2 (5) que contiene 3 cambios en su secuencia de aminoácidos y que es capaz de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación. Estas nuevas enzimas constituyen una nueva clase (cuya primera representante es la SHV-2, aislada un año antes) que se conoce con el nombre de betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado (grupo 2be de Bush, Jacoby y Medeiros). Durante los siguientes 6 o 7 años parece haberse producido una explosión de diversidad de betalactamasas de tipo TEM. Se aíslan y caracterizan más de 30 variantes de TEM-1 y TEM-2 que presentan el espectro de sustrato ampliado o una menor sensibilidad a los inhibidores suicidas.

Paralelamente se producen nuevos fenómenos:

1) Las bacterias asocian la producción de betalactamasas a mutaciones cromosómicas que, por ejemplo, disminuyen o anulan la producción de alguna porina específica.

2) Las bacterias aprenden a sobreproducir TEM (promotores más potentes, plásmidos con más copias). Esta sobreproducción permite la hidrólisis de sustratos para los que las enzimas de tipo TEM tienen baja actividad y, además, disminuye la efectividad de los inhibidores (al incrementarse el número de dianas alguna enzima es capaz de escapar a su acción).

3) Las bacterias combinan en una misma célula la producción de dos TEM diferentes (por ejemplo TEM-1 más TEM-27) (6), o de una TEM más otro tipo de betalactamasa, lo que permite tener una mejor tasa de hidrólisis combinada para muchos de los posibles sustratos. Desde el punto de vista evolutivo, este tercer fenómeno adaptativo plantea una interesante pregunta: ¿pueden las bacterias utilizar la diploidía (en este caso dos alelos diferentes del mismo gen) como medio para ensayar nuevas combinaciones de mutaciones sin peligro de perder la actividad protectora de la enzima original?

En resumen, la evolución de las betalactamasas de tipo TEM ha seguido, aparentemente, varios caminos: a) cuantitativo, que implica el aumento de la presencia de la enzima tanto en la población (diseminación de los genes mediante plásmidos y transposones) como en los individuos (aumento en la producción por mutaciones en el promotor o por aumento en el número de copias del plásmido portador); y b) cualitativo, que implica una especialización de la enzima en la hidrólisis de nuevos sustratos mediante la adquisición de mutaciones (7).

Las nuevas variantes de TEM-1 o TEM-2 con actividad hidrolítica sobre las cefalosporinas de tercera generación y los monobactames son el resultado de la presencia de un cambio, o la combinación de varios, en las posiciones 39, 104, 164, 237, 238, 240 y 265. Los cambios Glu104 »Lys, Arg164238 »Ser y Glu240 »Lys son capaces por sí mismos (en ausencia de otros) de conferir actividad sobre los citados betalactámicos (8-10). Además, la combinación en la misma molécula de más de uno de estos cambios supone, en la mayoría de los casos, un aumento sustancial en la actividad (mayor que la mera suma de las actividades conferidas por las mutaciones por separado). Los cambios Gln39 »Lys y Thr265 »Met se han considerado clásicamente como neutros en el sentido de que no modifican la actividad de las enzimas que los poseen (11). Sin embargo, estudios detallados indican que ambas mutaciones pueden modificar la actividad enzimática (7, 12, 13) y su capacidad de selección (Negri y Baquero, comunicación personal). Por último, el cambio Ala237 »Thr se ha descrito como causa, en ausencia de otros, del incremento en la actividad sobre las cefalosporinas (14). Estudios realizados en nuestro laboratorio muestran que la introducción mediante mutagénesis dirigida de dicho cambio en la molécula de TEM-1 no modifica de modo sustancial la actividad frente a las cefalosporinas de tercera generación (7). La introducción de la citada mutación en TEM-10 (variante con dos cambios: Ser164, Lys240) da lugar a TEM-5. La nueva variante confiere a la cepa portadora una resistencia a la cefotaxima que se ve incrementada en 4 veces con respecto a TEM-10 (15). Así, el efecto de los cambios de aminoácidos en las moléculas de TEM-1 y TEM-2 se debe interpretar en relación con las otras posibles modificaciones acompañantes y no como cambios aislados. Los cambios, considerados hasta el momento como neutros, pueden desempeñar un papel importante en la evolución de las betalactamasas de tipo TEM, actuando como mutaciones compensatorias de algunas deficiencias en la actividad originadas por otras mutaciones más activas. »Ser (o His), Gly

Pese a la gran diversidad de betalactamasas de espectro ampliado de tipo TEM, llama la atención que todas ellas sean el resultado de la combinación de sólo 7 cambios en la secuencia. Estudios de mutagénesis sobre diferentes regiones de la proteína muestran que existe un gran número de mutaciones capaces de incrementar la actividad, por ejemplo, sobre ceftazidima (16, 17). Pero muchas de esas mutaciones determinan una gran disminución de la actividad hidrolítica sobre otros betalactámicos. Sólo unas pocas son capaces de mantener un buen nivel de actividad frente a un número elevado de sustratos. La mayoría de éstas coincide con las encontradas en las TEM aisladas en cepas clínicas.

En el marco clínico, la situación pudo ser muy similar. El uso de los nuevos betalactámicos no fue seguido por un descenso sustancial en la utilización de los primitivos. Esta situación pudo crear un problema adaptativo a las bacterias entéricas con betalactamasas de tipo TEM. Debían enfrentarse de forma consecutiva a moléculas nuevas y antiguas. Así, las mutaciones que observamos en las TEM naturales son el resultado de la selección por diferentes agentes de forma alternante y no por un solo agente que actúa de manera uniforme.

A partir de 1990 comienzan a aislarse variantes de TEM con menor sensibilidad a los inhibidores suicidas de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam). Con estas nuevas variantes se inaugura un nuevo grupo en la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros: el 2br. Tras el uso tentativo de varias denominaciones, en la actualidad parece ampliamente aceptado el nombre de IRT (Inhibitor Resistant TEM) para estas nuevas enzimas (18). De forma similar a lo acontecido con las TEM de espectro ampliado, las IRT muestran un rápido proceso de diversificación. En unos pocos años se han descrito 13 variantes moleculares, todas ellas resultado de un cambio, o de la combinación de varios cambios, en alguno de los aminoácidos siguientes: Met69, Trp165, Met182, Arg244, Arg275 y Asn276.

Durante los últimos 6 años las IRT y las TEM de espectro ampliado han coexistido sin mezclar sus mutaciones. De hecho, la inclusión en la misma molécula de enzima de los dos tipos de mutaciones confería solamente el fenotipo de ampliación del espectro, perdiéndose la resistencia a los inhibidores. Los microorganismos, seguramente los mejores ingenieros genéticos, es muy probable que encuentren el modo de solucionar esta incompatibilidad (posiblemente por mutaciones compensatorias).

Bibliografía

1. Bush, K., Jacoby, G.A., Medeiros, A.A. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39.
2. Datta, N., Kontomichalou, P. Nature 1965; 208: 239-241.
3. Lowbury, E.J.L., Kidson, A., Lilly, H,A., Ayliffe, G.A.J., Jones, R.J. Lancet 1969; ii: 448-452.
4. Brun-Buisson, C., Legrand, P., Philippon, A., Montravers, F., Ansquer, M., Duval, J. Lancet 1987; 2: 302-306.
5. Sougakoff, W., Petit, A., Goussard, S., Sirot, D., Bure, A., Courvalin, P. Gene 1989; 78: 339-348.
6. Morosini, M.I., Blázquez, J., Negri, M.C., Cantón, R., Loza, E., Baquero, F. J Infect Dis 1996; 174: 1015-1020.
7. Baquero, F., Blázquez, J. Simposium: New horizons in betalactamases. 6th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 1993.
8. Blázquez, J., Morosini, M.I., Negri, M.C., González-Leiza, M., Baquero, F. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 145-149.
9. Chanal, C., Poupart, M.C., Sirot, D. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 1817-1820.
10. Sowek, J.A., Singer, S.B., Ohringer, S., Malley, M.F., Dougherty, T.J., Gougoutas, J.Z., Bush, K. Biochem 1991; 30: 337-342.
11. Knox, J. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2593-2601.
12. Chaïbi, E.B., Farzaneh, S., Péduzzi, J., Barthélémy, M., Labia, R. FEMS Microbiol Lett 1996; 143: 121-125.
13. Huang, W., Le, O.Q., LaRocco, M., Palzkill, T. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 2266-2269.
14. Healey, W.J., Labgold, M.R., Richards, J.H. Proteins. Struct Funct Genet 1989; 6: 275-283.
15. Blázquez, J., Sánchez, L., Negri, M.C., Morosini, M.I., Gómez-Gómez, J.M., Baquero, F., Valencia, A. 36 ICAAC, New Orleans, USA 1996; Abst.
16. Palzkill, T., Botstein, D. J Bacteriol 1992; 174: 5237-5243.
17. Venkatachalam, K.V., Huang, W., LaRocco, M., Palzkill, T. J Biol Chem 1994; 269: 23444-23450.
18. Blázquez, J., Baquero, M.R., Cantón, R., Alós, R., Baquero, F. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 2059-2063.

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Epidemiología de las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado.

C. Ardanuy

Servicio de Microbiología, Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge, L'Hospitalet de Llobregat, Barcelona.

La incorporación a la terapéutica de las cefalosporinas de tercera generación y de los monobactames, resistentes a la hidrólisis por betalactamasas clásicas, supuso un importante avance en el tratamiento de las infecciones causadas por enterobacterias. En 1983 se detectaron en Alemania los primeros aislamientos clínicos de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli resistentes a estos antibióticos por producción de una betalactamasa plasmídica transferible por conjugación (1, 2). Estas enzimas fueron denominadas betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado (BLEA) y corresponden al grupo 2be de la clasificación de Bush y cols. (3).

Las BLEA derivan de las betalactamasas plasmídicas clásicas por mutaciones concretas en los genes que las codifican, originando cambios en su secuencia de aminoácidos. Estas mutaciones han dado lugar a una gran variedad de enzimas (de TEM-3 a TEM-29 y de SHV-2 a SHV-7) (3, 4).

A finales de la década de 1980 se describen en Francia los primeros brotes nosocomiales producidos por cepas de K. pneumoniae productoras de BLEA (5, 6). Desde entonces se han documentado numerosos brotes nosocomiales por todo el mundo causados por diferentes especies de enterobacterias con este patrón de resistencia enzimática (7, 8). Un estudio reciente realizado en Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) de 10 países europeos, demostró que un 22,8% de los aislamientos de Klebsiella sp. eran productores de BLEA, siendo K. pneumoniae la especie más importante (9).

La producción de estas enzimas confiere resistencia a penicilinas, cefalosporinas y monobactames. Los carbapenemes y las cefamicinas no son hidrolizados por este grupo de betalactamasas. Las combinaciones de penicilinas con inhibidores de betalactamasas pueden ser activas, aunque se han descrito casos de resistencia por hiperproducción de BLEA y por producción conjunta de BLEA y SHV-1 (10, 11).

Los plásmidos que codifican la producción de estas enzimas se transfieren fácilmente entre distintas especies bacterianas por conjugación, y además pueden llevar asociados mecanismos de resistencia a otros grupos de antibióticos, lo que dificulta el tratamiento de las infecciones acusadas por estos microoganismos (12).

El hallazgo de enterobacterias productoras de BLEA puede ser esporádico, sin relación clonal, o bien dar lugar a brotes nosocomiales generalmente originados por un mismo clon bacteriano. Estas epidemias suelen afectar a un número reducido de pacientes, aunque también pueden ser de mayor extensión y originar una situación endémica.

Los brotes nosocomiales causados por enterobacterias productoras de BLEA pueden deberse a la diseminación horizontal de un plásmido por conjugación entre diferentes especies bacterianas, o bien a la diseminación de un clon bacteriano multirresistente. Estas epidemias intrahospitalarias surgen principalmente en las UCI y se asocian a un consumo elevado de cefalosporinas de tercera generación. La colonización fecal es importante porque actúa de reservorio de estos microrganismos y facilita la transmisión de esta resistencia a otras enterobacterias. La transmisión horizontal de paciente a paciente mediante la manipulación por el personal sanitario es la forma más frecuente de diseminación de una cepa epidémica (6, 7). Los factores de riesgo asociados a infección y/o colonización por estos microorganismos son: estancia prolongada en UCI, cateterización arterial o urinaria y consumo de antibióticos.

En el control de estos brotes han resultado eficaces la restricción del uso de cefalosporinas de tercera generación, la educación del personal sanitario y la aplicación de medidas de barrera (aislamiento cutáneo) (8). La descontaminación intestinal es una medida cuestionada, ya que puede seleccionar otros microorganismos multirresistentes.

Con los criterios del NCCLS, algunos de los microorganismos productores de BLEA podrían considerarse sensibles a las cefalosporinas de tercera generación, (7) por lo que para detectar la producción de BLEA deben utilizarse los métodos de la sinergia de doble difusión con disco (entre cefalosporinas de tercera generación y ácido clavulánico) o el método de difusión de E-test (ceftazidima y ceftazidima/ácido clavulánico).

En nuestra experiencia, durante una epidemia de origen clonal causada por K. pneumoniae productora de BLEA se vieron afectados 145 pacientes, de los que el 69,6% estaban ingresados en la UCI (13). La cepa epidémica presentaba resistencia a cefalosporinas de tercera generación, aztreonam, gentamicina y ciprofloxacino, y producía dos tipos de BLEA con pI de 7,6 y 8,2. En tres estudios de incidencia de colonización fecal por K. pneumoniae productor de BLEA realizados en las UCI de nuestro hospital, se detectó en el 41% de los pacientes en 1993, en el 35,6% en 1994 y en el 5% en 1995 (14). La eradicación del brote se consiguió mediante la aplicación de medidas de barrera, la restricción en el uso de cefalosporinas de tercera generación en las UCI y el seguimiento diario de los casos nuevos.

Bibliografía

1. Shah, P.M., Stille, W. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains more susceptible to cefoxitin than to third generation cephalosporins. J Antimicrob Chemother 1983; 11: 597-601.
2. Knothe, H., Shah, P., Kremery, V., Antal, M., Mitsuhashi, S. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection 1983; 11: 615-617.
3. Bush, K., Jacoby, G., Medeiros, A. A functional clasification scheme for betalactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2322-1233.
4. Knox, J.R. Extended-spectrum and inhibitor-resistant TEM-type betalactamases: Mutations, specifity, and three-dimensional structure. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2593-2601.
5. Sirot, D., Sirot, J., Labia, R., Morand, A., Courvalin, P., Darfeuille-Michaud, A., Perroux, R., Cluzel, R. Transferable resistance to third generation cephalosporins in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae: Identifications of CTX-1, a novel betalactamase. J Antimicrob Chemother 1987; 20: 323-334.
6. Arlet, G., Rouveau, M., Casin, I., Bouvet, P., Lagrange, P., Philippon, A. Molecular epidemiology of Klebsiella pneumoniae strains that produce SHV-4 betalactamase in 14 French hospital. J Clin Microbiol 1994; 32: 2553-2558.
7. Fernández-Rodríguez, A.Z., Reguera, J.A., Pérez-Díaz, J.C., Picazo, J.J., Baquero, F. Primera epidemia española de resistencia plasmídica a cefalosporinas de tercera generación: Implicación de SHV-2. Enf Infec Microbiol Clin 1992; 10: 456-461.
8. Meyer, K., Urban, C., Eagan, J., Berget, B., Rahal, J. Nosocomial outbreak of Klebsiella infection resistant to late-generation cephalosporins. Ann Intern Med 1993; 119: 353-358.
9. Livermore, D.M., Yuan, M. Antibiotic resistance and production of extended-spectrum betalactamases amongst Klebsiella spp. from intensive care units in Europe. J Antimicrob Chemother 1996; 38: 409-424.7
10. Rice, L.B., Carias, L.L., Bonomo, R.A., Shales, D.M. Molecular genetic of resistance to both ceftazidime and betalactam-betalactamase inhibitor combinations in Klebsiella pneumoniae and in vivo response to betalactam therapy. J Infect Dis 1996; 173: 151-158.
11. French, G.L., Shannon, K.P., Simmons, M. Hospital outbreak of Klebsiella pneumoniae resistant to broad spectrum cephalosporins and betalactam-betalactamases inhibitor combinations by hyperproduction of SHV-5 betalactamase. J Clin Microbiol 1996; 34: 358-363.
12. Fernández-Rodríguez, A., Cantón, R., Pérez-Díaz, J.C., Martínez-Beltrán, J., Picazo, J.J., Baquero, F. Aminoglycoside-modifying enzymes in clinical isolates harboring extended-spectrum betalactamases. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 2536-2538.
13. Peña, C., Pujol, M., Ardanuy, C., Ricart, A., Pallarés, R., Liñares, J., Ariza, J., Gudiol, F. Clinical and molecular epidemiology of a large outbreak due to extended-spectrum betalactamases producing Klebsiella pneumoniae. Impact of third-generation cephalosporins restriction in its control. 36th Interscience Conference on Antimicrob Agents and Chemotherapy, New Orleans, Louisiana, USA, September 1996.
14. Peña, C., Pujol, M., Ricart, A., Ardanuy, C., Ayats, J., Liñares, J., Garrigosa, F., Ariza, J., Gudiol, F. Risk factors for fecal carriage of Klebsiella pneumoniae producing extended spectrum betalactamase (ESBL-KP) in the intensive care unit. J Hosp Infect (en prensa).

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Novedades en la relación entre inhibidores de betalactamasas y betalactámicos.

M.A. Torrellas

Dpto. Investigación Clínica, SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Madrid.

Para el estudio de la actividad in vivo de un antimicrobiano hay que distinguir los factores bacterianos que contribuyen directamente a la virulencia bacteriana, como la tasa de crecimiento bacteriano y productos metabólicos (enzimas degradantes de antibióticos), de la presencia de productos exógenos como antibióticos y/o inhibidores de las enzimas hidrolizantes y los factores del huésped (1).

Con objeto de realizar una aproximación novedosa al estudio de las interacciones dinámicas entre inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico) y betalactámicos (amoxicilina), revisaremos los estudios realizados acerca del efecto que sobre la viabilidad bacteriana y la actividad enzimática de dos cepas tipo, productoras de betalactamasas, puede tener la exposición continua de concentraciones de ácido clavulánico y/o de amoxicilina similares a las obtenidas en suero humano de voluntarios sanos tras una dosis única oral de 875 mg de amoxicilina/125 mg de ácido clavulánico (2, 3).

Para ello se utilizó un modelo in vitro de simulación farmacodinámica continua que tiene en cuenta el efecto carry-over a lo largo de 12 horas (4).

Los resultados obtenidos se pueden concretar en los siguientes puntos:

1) Concentraciones fisiológicas de ácido clavulánico incrementan el tiempo de generación celular de ambas cepas.

2) El ácido clavuláncio inhibe la actividad de las betalactamasas de ambas cepas durante 12 horas, a pesar de que a partir de las 6 horas no existen concentraciones apreciables en suero en la simulación farmacodinámica (5, 6).

Cuando se estudia el efecto combinado de amoxicilina/clavulánico en simulación farmacodinámica se obtiene una reducción del 98% de un inóculo inicial de 8,5 x 106 UFC/ml de Staphylococcus aureus a las 12 h a pesar de la no existencia de ácido clavulánico a partir de las 6 h y de amoxicilina a partir de las 8 h (7).

Fenómenos como el PLIE (tiempo de recuperación de la actividad betalactamasa con respecto a un control, tras la desaparición del ácido clavulánico), el PAE (tiempo de supresión del crecimiento bacteriano con respecto al control tras la exposición al antimicrobiano) y la prolongación del PAE por concentraciones subinhibitorias pudieran explicar estas observaciones.

Por último, indicar que el estudio de los efectos in vitro de simulaciones farmacodinámicas de ácido clavulánico en la viabilidad y en la actividad betalactamasa bacteriana, junto con el efecto combinado del ácido clavulánico con el antibiótico, ayudaría a explicar la actividad antimicrobiana in vivo. Estos resultados pueden tener implicaciones explicativas en esquemas de dosificación terapéutica.

Bibliografía

1. Lorain, V., Gemmell, C.G. Effect of low antibiotic concentrations on bacteria: Effects on ultrastucture, virulence and susceptibility to immunodefenses. En: De Lorian, V. (Ed.). Antibiotics in Laboratory Medicine, Third Edition. Williams & Wilkins, Baltimore 1991; 493-555.
2. Adam, D., De Visser, I., Koeppe, P. Pharmacokinetics of amoxicillin and clavulanic acid alone and in combination. Antimicrobial Agents Chemotherapy 1982; 22: 353-357.
3. Fraschini, F., Scaglione, F., Falchi, M. y cols. Pharmacokinetics and tissue distribution of amoxicillin plus clavulanic acid after oral administration in man. J Chemotherapy 1990; 2: 171-177.
4. Balcabao, I.P., Aguilar, L., Martín, M., García, Y., Dal-Ré, R., Prieto, J. Bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae of amoxicillin and cefotaxime physiological concentrations: In vitro pharmacodynamic simulation. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40 (12).
5. Martín, M., Aguilar, L., Balcabao, I.P., Gómez-Lus, M.L., Dal-Ré, R., Prieto, J. In vitro pharmacodynamic simulation of clavulanic acid concentrations on Staphylococcus aureus and Haemophilus influenzae betalactamase activity. J Antimicrob Chemother (en prensa).
6. Balcabao, I.P., Prieto, J., Aguilar, L., Martín, M., Dal-Ré, R. Comparative in vitro effects of clavulanic acid (CA) physiological concentrations on Staphylococcus aureus (SA) and Haemophilus influenzae (HI) viability and betalactamase activity. 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Vienna 1995; Abstract Nº 531.
7. Balcabao, I.P., Prieto, J., Aguilar, L., Martín, M., Dal-Ré, R. Comparative in vitro effects of amoxicillin-clavulanic acid (AC) physiological concentrations on Staphylococcus aureus (SA) viability and betalactamase activity. 66th International Congress for Infectious Diseases, Prague 1994; Abstract Nº 123

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Cefalosporinas inducibles:de AmpC a las cefamicinas plasmídicas

L. Martínez Martínez

Dpto. de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla.

CEFALOSPORINASAS CROMOSÓMICAS

Prácticamente todas las bacterias gramnegativas poseen una cefalosporinasa cromosómica. El tipo de enzima varía en función del microorganismo: algunos producen enzimas de clase A (de forma constitutiva, como Klebsiella o Bacteroides fragilis, o de forma inducible, como Citrobacter diversus o Proteus vulgaris), pero más frecuentemente la betalactamasa es de clase C (BLS-C). Escherichia coli y Shigella sonneii producen una baja cantidad no inducible de enzima, mientras que Enterobacter cloacae, E. aerogenes, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia sp., Providencia sp., Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos producen una betalactamasa inducible.

Las BLS-C (clase I de Richmond-Sykes; grupo 1 de Bush-Jacoby-Medeiros) son enzimas con un sitio activo de serina, de unos 30-42 kD, con pI básicos, fundamentalmente cefalosporinasas, aunque también inactivan penicilinas. No se inhiben por ácido clavulánico, pero sí por cloxacilina.

La importancia clínica de las BLS-C cromosómicas depende de dos procesos relacionados, pero conceptualmente muy diferentes: inducción y desrepresión. La inducción es la activación transitoria, reversible, de la síntesis de betalactamasa cromosómica en respuesta a la presencia de sustancias (inductores) entre las que se incluyen los betalactámicos y algunos compuestos orgánicos. La cantidad de enzima producida depende del tipo de inductor, de la cantidad de éste y del tiempo de inducción. Los mejores inductores son las cefamicinas (más cefoxitina y bastante menos cefotetan) y los carbapenemes (más imipenem que meropenem). Tanto ampicilina como cefaloridina son muy lábiles (se degrada una gran cantidad de moléculas por unidad de tiempo) e inductoras fuertes de la enzima, con lo que determinan su autoinactivación. Las cefalosporinas de segunda y tercera generación, aztreonam, las ureidopenicilinas y las carboxipenicilinas son también lábiles (en grado variable, dependiendo del compuesto), pero débiles inductoras. Cefepima y cefpiroma son más estables a la hidrólisis que las cefalosporinas de tercera generación, y poco inductoras. Imipenem es un fuerte inductor, pero al ser muy estable a la acción hidrolítica de la enzima (incluso en caso de desrepresión) pierde poca actividad, a no ser que exista un mecanismo de resistencia adicional (por ejemplo disminución de la permeabilidad). Meropenem es un peor inductor y aún más estable a la enzima. Los inhibidores de betalactamasas plasmídicas poseen diferente actividad como inductores de BLS-C, pero la significación clínica de la inducción por este tipo de compuestos es poco conocida porque sobreviene a concentraciones de inhibidor difícilmente alcanzables in vivo.

La desrepresión es un proceso de producción permanente de la enzima, con independencia de la presencia o no de betalactámico. La desrepresión de la enzima puede ser parcial (cuando la cantidad de enzima producida aún puede aumentarse en presencia de un inductor) o total. En P. aeruginosa aparecen mutantes parcialmente desreprimidas a una frecuencia de aproximadamente 10-7, y mutantes totalmente desreprimidas en torno a 10-9, mientras que en Enterobacter sp. aparecen mutantes totalmente desreprimidas con una frecuencia entre 10-5 y 10-7.

La mayoría de los estudios sobre la base genética del proceso de inducción se han realizado en Citrobacter freundii y en Enterobacter cloacae. El gen estructural es ampC y está sometido al control de AmpR. La proteína AmpR actúa como represora de la transcripción de ampC en condiciones basales (de no inducción) y como activadora de la transcripción en condiciones de inducción. El ampR pasa de la forma represora a la forma activadora cuando AmpR interacciona en el citoplasma bacteriano con un producto soluble derivado de la degradación/reciclado del peptidoglucano (el compuesto más importante en este sentido es el anhidro-acetil-murámico-l-lisina-d-glutámico-meso-diaminopimélico, NAMT), cuyos niveles aumentan, presumiblemente, como consecuencia de la inhibición de las proteínas fijadoras de penicilina por parte de los betalactámicos (inductores). Hay al menos otros tres genes que intervienen en el control de la inducción de AmpC: ampD, ampE y ampG. El ampD produce una proteína soluble que actúa como amidasa degradando el NAMT, disminuyendo la concentración intracitoplásmica de este metabolito. Las mutaciones en ampD (las más importantes en clínica) dan lugar a la desrepresión o la hiperinducibilidad de la síntesis de AmpC. La AmpG es una proteína de membrana que actúa como transportador del NAMT desde el periplasma al interior del citoplasma bacteriano y contribuye a que los niveles de este metabolito en el citoplasma se eleven. La AmpE es una proteína citoplásmica que probablemente actúe como un sensor de betalactámicos, contribuyendo a aumentar el efecto represor de AmpD, pero parece ser indispensable en todo el proceso y su papel no ha sido aclarado aún convincentemente. Se han descrito otros genes (pbpA, ftsZ) relacionados también con el control de la producción de AmpC inducible, pero el mecanismo implicado es desconocido.

En E. coli y S. sonnei la expresión de AmpC es constitutiva, y en condiciones normales se producen cantidades mínimas de enzima. En E. coli no existe ampR, el promotor de ampC es poco eficaz y además existe un atenuador entre el promotor y el gen estructural. Se han descrito cepas de E. coli hiperproductoras de AmpC por amplificación del gen o por mutaciones que afectan al atenuador o al promotor de ampC.

Las enterobacterias con AmpC inducible producen cantidades escasas de enzima en ausencia de inductor. Tanto las cepas inducibles como las desreprimidas de Enterobacter, C. freundii, M. morganii y S. marcescens son resistentes a ampicilina y cefalosporinas de corto espectro; las dos primeras especies son también resistentes a cefoxitina, pero este antimicrobiano es moderadamente eficaz frente a M. morganii, S. marcescens y Providencia sp. Las ureido y carboxipenicilinas y las cefalosporinas de tercera generación son activas frente a cepas inducibles, pero no frente a las cepas desreprimidas. Los carbapenemes y las cefalosporinas de cuarta generación son, en general, activos frente a cepas desreprimidas, excluyendo las cepas desreprimidas de Enterobacter que no expresan porinas. En P. aeruginosa el grado de resistencia depende de la cantidad de enzima producida por el proceso de inducción/desrepresión: las ureidopenicilinas se afectan incluso con pequeñas cantidades de enzima, pero las cefalosporinas de cuarta generación y la carbenicilina sólo se afectan de forma significativa cuando existe una desrepresión total; la resistencia a los carbapenemes en esta especie depende también de alteraciones de la permeabilidad y (al menos para algunos compuestos) de la existencia de bombas de eflujo.

Se calcula que aparecen mutantes desreprimidas en un 7% a 40% de los pacientes que sufren infección por agentes con AmpC inducible. En P. aeruginosa se ha observado selección de cepas desreprimidas en relación con el uso de ureidopenicilinas, piperacilina y cefalosporinas de tercera generación. En las enterobacterias esta selección depende fundamentalmente del empleo de cefalosporinas de tercera generación. En un 25% a 75% de aquellos pacientes en que aparecen mutantes resistentes sobreviene un fallo terapéutico, con más frecuencia en infecciones respiratorias u óseas que en infecciones urinarias (probablemente por la alta concentración de fármaco alcanzada en el tracto urinario).

Cefamicinasas Plasmídicas

Las betalactamasas codificadas por plásmidos tienen, en general, propiedades diferentes de las enzimas de tipo cromosómico, pero en algunos casos es difícil establecer si una enzima debe considerarse cromosómica o plasmídica: SHV-1 es una betalactamasa muy comúnmente codificada por plásmidos, pero también por el cromosoma de K. pneumoniae. Se ha demostrado una relación evolutiva entre plásmidos que codifican enzimas tipo TEM y la enzima cromosómica de K. pneumoniae LEN-1, y que las enzimas plasmídicas MEN-1 y FEC-1 guardan una estrecha relación con la betalactamasa cromosómica de clase A de K. oxytoca.

La mayoría de las betalactamasas codificadas por plásmidos no confieren resistencia a las cefamicinas. Esta característica ayuda a reconocer fenotípicamente las cepas productoras de betalactamasas plasmídicas de espectro extendido tradicionales. En los últimos años, sin embargo, se han descrito betalactamasas plasmídicas que confieren resistencia no sólo a cefalosporinas de tercera generación sino también a cefamicinas, por lo que se conocen como cefamicinasas plasmídicas. La mayor parte de estas enzimas se han descrito en K. pneumoniae, aunque también se han identificado en E. coli y en Achromobacter sp. Las representantes mejor caracterizadas son MIR-1, MOX-1, CMY-1, CMY-2, BIL-1, LAT-1 y FOX-1 y algunas otras enzimas recientemente identificadas todavía sin denominación específica.

Las cepas con cefamicinasas plasmídicas se han descrito tanto de forma epidémica como ocasional. Los plásmidos implicados son tanto conjugativos como no conjugativos (incluso para el mismo tipo de enzima) y de muy variado tamaño. Este tipo de enzimas suelen tener un pI básico, incluso superior a 10, y confieren resistencia a cefamicinas y cefalosporinas (incluidas las de tercera generación), pero no a carbapenemes. No se inhiben por ácido clavulánico pero sí por aztreonam, lo que las asemeja a las BLS-C anteriormente comentadas. Se conocen las bases genéticas que controlan la producción de estas enzimas en bastantes casos y se ha comprobado que el gen estructural tiene una alta homología con AmpC de C. freundii (en la mayoría de los casos), de E. cloacae o de P. aeruginosa. Dicho gen estructural no se acompaña de un gen equivalente a ampR y en consecuencia la enzima se produce de forma constitutiva.

El descubrimiento de las cefamicinasas cromosómicas podría sugerir la posibilidad de que los distintos tipos de enzimas codificadas por plásmidos tengan un origen cromosómico, aunque en la actualidad desconozcamos el organismo que inicialmente sirvió como fuente para la transmisión de la información del cromosoma al plásmido.

Bibliografía

1. Seeberg, A., Tolxdorff, N., Neutzling, M., Wiedemann, B. Chromosomal betalactamases of Enterobacter cloacae are responsible for resistance to third-generation cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother 1983; 23: 918-925.
2. Vu, H., Nikaido, H. Role of betalactam hydrolysis in the mechanism of resistance of a betalactamase-constitutive Enterobacter cloacae strain to expanded-spectrum betalactams. Antimicrob Agents Chemother 1985; 393-398.
3. Lindberg, F., Normark, S. Contribution of chromosomal betalactamases to betalactam resistance in enterobacteria. Rev Infect Dis 1986; 8 (Suppl. 3): S292-S304.
4. Papanicolau, G., Medeiros, A.A., Jacoby, G.A. Novel plasmid-mediated betalactamase (MIR-1) conferring resistance to oxyimino- and a-methoxy betalactams in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 2200-2209.
5. Bennett, P.M., Chopra, I. Molecular basis of betalactam induction in bacteria. Antimicrob Agents Chemother 1993; 153-158.
6. González-Leiza, M., Pérez-Díaz, J.C., Ayala, J., Casella, J.M., Martínez-Beltrán, J., Bush, K., Baquero, F. Gene sequence and biochemical characterization of FOX-1 from Klebsiella pneumoniae, a new AmpC-type plasmid-mediated betalactamase with two molecular variants. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 2150-2157.

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Carbapenemasas.¿Un nuevo reto para la antibioterapia?

R. Cantón

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

Los carbapenemes, representados en España por el imipenem y más recientemente por el meropenem, constituyen el grupo de antibióticos betalactámicos más estables a la hidrólisis por las betalactamasas. Son resistentes a la acción de la mayoría de estas enzimas, incluyendo AmpC y las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado de tipo TEM, SHV y OXA. Durante años, la única carbapenemasa conocida fue la descrita en Bacillus cereus (betalactamasa II), considerándose una curiosidad de laboratorio. Posteriormente se comprobó que Stenotrophomonas maltophilia, Chryseobacteriun odoratum, Legionella gormanii y algunos aislamientos de Bacteroides fragilis producían también enzimas de carácter cromosómico capaces de hidrolizar estos compuestos. La reciente identificación y caracterización de carbapenemasas plasmídicas en Pseudomonas aeruginosa, en diferentes especies de Enterobacteriaceae y en Acinetobacter ha generado un mayor interés por su estudio y puede suponer un nuevo reto para la antibioterapia.

La resistencia a los carbapenemes no está determinada en exclusiva por la producción de carbapenemasas, ya que existen al menos otros tres mecanismos que pueden afectar a su actividad: pérdida de porinas específicas, bombeo o expulsión del antibiótico y modificaciones en las proteínas fijadoras de penicilina (PBP). Con la excepción de P. aeruginosa y otros bacilos gramnegativos no fermentadores, la resistencia a los carbapenemes es todavía infrecuente, y en algunos casos es necesaria la superposición de más de un mecanismo para que esta resistencia tenga relevancia clínica.

Atendiendo a la clasificación molecular de Ambler, las carbapenemasas pueden estructurarse en dos grupos (Tabla 1). El primero está representado por las de clase B (grupo 3 de la clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros), son metaloenzimas y requieren zinc para su actuación. Son inhibidas por EDTA, pero no por ácido clavulánico. Estas enzimas también hidrolizan las penicilinas y cefalosporinas, incluyendo las cefamicinas. Sin embargo, la ticarcilina y el aztreonam son sustratos débiles. Las metaloenzimas son generalmente de naturaleza cromosómica, aunque recientemente se han asociados a plásmidos conjugativos. Son inducibles y se han encontrado en S. maltophilia (betalactamasa L1), Aeromonas sp. (A2, CphA), B. cepacia (PCM-1) y B. fragilis (CcrA). Por el contrario, las plasmídicas de este grupo son enzimas constitutivas y se han descrito en S. marcescens (IMP-1), P. aeruginosa y B. fragilis.

Tabla1.Carbapenemasas.

*Crm: localización cromosómica; PI: localización plasmídica.

Las carbapenemasas descritas en S. marcescens y P. aeruginosa hidrolizan a imipenem y meropenem con una eficacia similar, si bien el grado de resistencia es discretamente mayor frente al meropenem, particularmente en P. aeruginosa. Asimismo, las carbapenemasas cromosómicas y plasmídicas de B. fragilis hidrolizan algo mejor el meropenem que el imipenem. El gen cromosómico (cfiA o ccrA) puede ser silente y expresarse con diferentes grados, dependiendo de la presencia de un elemento de inserción en el codón de iniciación del gen que codifica la betalactamasa.

La frecuencia real de aislamientos productores de carbapenemasas de clase B no es del todo conocida: casi el 100% de los aislamientos de S. maltophilia producen la metaloenzima L1; CphA está muy difundida entre las especies clínicas de Aeromonas, aunque es necesario un inóculo elevado (108 x UFC/ml) para demostrar un incremento en los valores de CMI del imipenem; y algunos autores han sugerido que todos los aislamientos de B. cepacia producen, además de una cefalosporinasa, una carbapenemasa poco eficiente, y que la expresión de estas enzimas es poco frecuente en B. fragilis (<3%). Asimismo, la descripción de las carbapenemasas en Acinetobacter sp. es extremadamente rara; sólo se han descrito las enzimas AbRc-1 en dos cepas aisladas en Francia y ARI-1 en otro aislamiento en Gran Bretaña. Ambas son de carácter plasmídico, habiéndose demostrado para ARI-1 la transferencia por conjugación a otras especies de Acinetobacter. Especial atención requieren los datos publicados acerca de la presencia de IMP-1 en P. aeruginosa en Japón (0,4% del total de aislamientos estudiados). Esta enzima, en muchos casos, es de carácter plasmídico y puede transferirse por electroporación a otras cepas de P. aeruginosa y Escherichia coli. La IMP-1 también se ha encontrado en Japón en S. marcescens (3,8%) y en Klebsiella pneumoniae, microorganismo considerado como vector "ideal" de plásmidos de resistencia. Asimismo, en el primer caso pudo transferirse por conjugación a E. coli la resistencia al imipenem.

El segundo grupo de enzimas que hidrolizan a los carbapenemes son serina betalactamasas de clase A (grupo 2f de Bush-Jacoby-Medeiros). A diferencia de las de clase B, son parcialmente inhibidas por el ácido clavulánico pero no por el EDTA. Estas enzimas son penicilinasas pero también hidrolizan eficazmente a los carbapenemes y al aztreonam. Por el contrario, hidrolizan débilmente a las cefalosporinas y, con la excepción de la enzima NMC-A, no hidrolizan a la cefoxitina. Por el momento sólo se han descrito tres carbapenemasas de clase A, todas ellas en Enterobacteriaceae: Sme-1 en dos cepas de S. marcescens aisladas en Inglaterra en 1982, IMI-1 en dos aislamientos de Enterobacter cloacae en Califomia en 1984, y NMC-A en una sola cepa de E. cloacae en París en 1990. Todas son inducibles, no transferibles y, al contrario que las carbapenemasas de clase B, la hidrólisis del imipenem es menor que la del meropenem. La producción de NMC-A y Sme-1 está controlada por reguladores de la familia LysR, NmcR y SmeR, respectivamente. Estas proteínas son reguladores positivos débiles estructuralmente relacionados con la proteína AmpR del sistema de regulación de la cefalosporinasa AmpC. Sin embargo, a diferencia del sistema AmpR-AmpC, actúan como inductores débiles tanto en ausencia como en presencia de antibióticos betalactámicos. Una diferente carbapenemasa de clase A se ha descrito de forma esporádica en Bacteroides distasonis, pero en éste la resistencia a los carbapenemes depende también de mecanismos relacionados con la permeabilidad.

En conclusión, a pesar del creciente uso de los carbapenemes, la mayoría de los bacilos gramnegativos continúan siendo sensibles a estos compuestos. En los aislamientos resistentes coexisten con frecuencia diferentes mecanismos para que la resistencia a los carbapenemes tenga relevancia clínica. La resistencia mediada por betalactamasas se debeesencialmente a metaloenzimas en patógenos de interés creciente (S. maltophilia y B. cepacia) y son raramente encontradas en Bacteroides y Enterobacteriaceae. Asimismo, las carbapenemasas de clase A se han encontrado ocasionalmente en E. cloacae y S. marcescens. La localización plasmídica de algunas metaloenzimas en P. aeruginosa, S. marcescens y K. pneumoniae, particularmente en países con una amplia utilización de carbapenemes, puede incidir en una mayor diseminación de la resistencia a estos antimicrobianos. Por ello, es urgente la investigación de nuevos betalactámicos que soslayen la resistencia a los carbapenemes, en particular la debida a carbapenemasas.

Bibliografía

1. Bush, K., Jacoby, G.A., Medeiros, A.A. A functional classification scheme of betalactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemoter 1995; 39: 1211-1233.
2. Livermore, D.M. Carbapenemases: The next generation of betalactamases? ASM News 1993; 59: 129-135.
3. Livermore, D.M. Betalactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 557-584.
4. Livingstone, D., Gill, M.J., Wise, R. Mechanisms of resistance to the carbapenems. J Antimicrob Chemother 1995; 35: 1-5.
5. Quin, J.P. Imipenem resistance in gram-negative bacilli. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 203-204.
6. Payne, D.J. Metalo-betalactamases – A new therapeutic challenge. J Med Microbiol 1993; 39: 93-99.

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Aspectos metodol&oaute;gicos del estudio de las betalactamasas: del fenotipo al genotipo.

J. Vila

Laboratorio de Microbiología, Hospital Clínico y Provincial, Barcelona.

Entre los mecanismos de resistencia a los antibióticos betalactámicos que las bacterias pueden presentar, sin duda alguna la síntesis de betalactamasas es el más común. Dado que la resistencia a los betalactámicos puede deberse a otros mecanismos además de a las betalactamasas, la primera aproximación para conocer la posible implicación de éstas en la resistencia será el análisis detallado del patrón de sensibilidad a los betalactámicos según al antibiograma y la detección de la actividad betalactamasa. En la evaluación de la resistencia a los antibióticos betalactámicos, el análisis fenotípico de los patrones de resistencia puede representar en algunos casos poder predecir la posible implicación de una betalactamasa determinada. La interpretación de los fenotipos de resistencia a betalactámicos se basa en comparar los aislamientos clínicos con un determinado perfil de resistencia con el prototipo de bacteria sensible perteneciente a la misma especie. Para obtener un fenotipo de resistencia que permita predecir la presencia de alguna betalactamasa deberíamos incluir en el antibiograma, por lo menos:

1) La sensibilidad a penicilinas con y sin inhibidor de betalactamasas.

2) La ceftazidima, que es el mejor indicador de betalactamasas de espectro ampliado (BLEA).

3) La cefoxitina, que es un buen indicador de betalactamasas inducibles en Enterobacter sp. y Citrobacter sp., y ayuda a comprobar si una Klebsiella posee una BLEA o una betalactamasa AmpC.

4) Un carbapenem, el cual escapa a la resistencia mediada por la mayoría de las betalactamasas.

También es preferible detectar la CMI de estos betalactámicos en lugar de realizar el clásico antibiograma disco-placa. Sin embargo, existe una serie de limitaciones del antibiograma como sistema para predecir el tipo de betalactamasa, tales como:

1) No poder utilizar este sistema para microorganismos en que la relación entre antibiograma y mecanismos de resistencia no está bien establecida.

2) Las cepas bacterianas con una expresión de la enzima excepcionalmente elevada o escasa pueden presentar comportamientos anómalos, especialmente con la combinación de inhibidores de betalactamasas.

3) La resistencia intrínseca de algunas especies a los antibióticos betalactámicos puede modificar el fenotipo conferido por la misma betalactamasa.

4) La predicción falla cuando el aislamiento clínico estudiado presenta varios mecanismos de resistencia o más de un tipo de betalactamasas.

Diversos ensayos se han utilizado para constatar la producción de betalactamasas. Los procedimientos más comúnmente utilizados en laboratorios clínicos incluyen los que utilizan una cefalosporina cromogénica, el acidimétrico y el yodométrico. Todos ellos se basan en la detección visual del producto final de la hidrólisis de un betalactámico por acción de la betalactamasa, mediante una reacción colorimétrica. No todos los métodos son útiles para la detección de betalactamasas en cualquier bacteria. De todos ellos el más utilizado es el de la nitrocefina (cefalosporina cromogénica). Este método, aunque caro, permite detectar la mayoría de betalactamasas conocidas. Para algunas bacterias existe una correlación directa entre producción de betalactamasas y resistencia a antibióticos betalactámicos específicos, por ejemplo Haemophilus influenzae y la resistencia a ampicilina. Sin embargo, para otros microorganismos, tales como las enterobacterias o Pseudomonas, la producción de betalactamasas no puede predecir totalmente la resistencia a varios antibióticos betalactámicos. El desarrollo de resistencia a diversos antibióticos betalactámicos es un problema en algunos bacilos gramnegativos, como Enterobacter sp., Citrobacter sp., etc., que poseen una betalactamasa cromosómica inducible. Se ha comprobado que en el 14% y el 65% de los pacientes infectados con estos microorganismos, la bacteria desarrolla resistencia. Para detectar la capacidad de producir una betalactamasa cromosómica inducible se ha diseñado una prueba muy simple que consiste en colocar un disco que contiene un inductor débil (cefotaxima o cefamandol) cerca de un disco que contiene un inductor fuerte (cefoxitina). La inducción se detecta por la deformación del halo de inhibición del inductor débil en la zona cercana al disco que contiene el inductor fuerte. Sin embargo, la sensibilidad de este método comparado con un ensayo directo de inducción es del 80%. Otro ensayo biológico similar al descrito anteriormente nos permite detectar la producción de BLEA cuando los aislamientos clínicos presentan una sensibilidad reducida a ceftazidima. Para ello se utiliza un disco de ceftazidima y otro de amoxicilina más ácido clavulánico. Cuando la zona de inhibición de la ceftazidima se ve aumentada por la presencia del ácido clavulánico, se puede inferir la presencia de BLEA.

Actualmente es frecuente encontrar microorganismos que producen tres o cuatro betalactamasas. Cuando varias betalactamasas son producidas en el mismo microorganismo, las propiedades biológicas de éste reflejarán una compleja mezcla de parámetros debido a la variedad de propiedades cinéticas de las diversas enzimas y a las cantidades relativas de cada una. Por ejemplo, si una BLEA es producida en un microorganismo que también posee un alto grado de expresión de una betalactamasa del grupo 1, el microorganismo no será altamente sensible a los efectos del ácido clavulánico. Por ello, organismos productores de diversas betalactamasas pueden ser más difíciles de identificar como organismos que producen BLEA. La determinación del punto isoeléctrico (pI) es un método ampliamente utilizado para la diferenciación de las betalactamasas. Mediante este método podemos comprobar si un microorganismo está produciendo una o varias betalactamasas e identificarla(s) mediante comparación con enzimas de cepas de referencia. Sin embargo, un problema potencial en la utilización de este método es que las isoenzimas con una sustitución en un único aminoácido que no genera un cambio sustancial en el perfil del sustrato se detectarán en el futuro con mayor frecuencia, por lo que una diferencia en el pI puede, en algunos casos, ser inadecuada para describir dos enzimas como diferentes.

Existen en la actualidad, dentro de la amplia variedad de betalactamasas, algunas con sólo ligeras diferencias en su punto isoeléctrico. Por ello, su identificación mediante isoelectroenfoque puede ser difícil y quizás motivo de error. Se han desarrollado diversas sondas de DNA para detectar betalactamasas mediante hibridación y así disponer de un método alternativo al isoelectroenfoque. Como sondas de DNA se han utilizado: 1) fragmentos de DNA del gen que se quiere detectar, aunque algunas veces pueden presentar hibridación cruzada con genes de otras betalactamasas no relacionadas; y 2) oligonucleótidos, que son mucho más específicos y permiten discriminar entre genes que se diferencian en un único nucleótido (por ejemplo TEM-1 y TEM-2). La principal desventaja de estas técnicas de hibridación es su complejidad de realización. Para soslayar este inconveniente se ha diseñado una serie de primers específicos que permiten detectar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las familias más importantes de betalactamasas (por ejemplo TEM, SHV). En algunos casos, la diferencia entre los miembros de estas familias estriba exclusivamente en una mutación concreta entre los genes. Existen en la actualidad diversas técnicas que permiten detectar mutaciones concretas a partir de productos de PCR; dos de ellas, la PCR-RFLP y la PCR-SSCP, se han utilizado para diferenciar genes de betalactamasas de la familia de las SHV. Una mutación concreta en el gen blaSHV que genera una sustitución del aminoácido Gly238 a Ser es la causa del cambio a una betalactamasa de espectro ampliado. Se ha comprobado que dicha mutación crea un lugar de restricción para la endonucleasa de restricción Nhe I. Por ello, la amplificación mediante PCR de la región que contiene este nucleótido y la posterior digestión con Nhe I es un método sencillo para distinguir entre SHV-1 y sus derivados de espectro ampliado. Por otro lado, la técnica de PCR-SSCP se ha utilizado también para diferenciar los diversos componentes de la familia de las betalactamasas SHV de espectro ampliado.

Como hemos mencionado a lo largo de esta exposición, en la actualidad se dispone de diversas técnicas sencillas y con elevada especificidad que nos permiten diferenciar entre las betalactamasas existentes. Distinguir entre betalactamasas es importante para la realización de estudios epidemiológicos, donde la presencia de un tipo de betalactamasa poco común permite el seguimiento de una cepa particular.

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