1996 Betalactamasas en la frontera del nuevo siglo


Bases moleculares de la evolución de la betalactamasas plasmídicas de tipo TEM.

Las betalactamasas de tipo TEM, incluidas en los grupos 2b, 2be y 2br de la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros (1), constituyen un grupo de enzimas que pertenecen a la clase molecular A. Estas betalactamasas han alcanzado un gran éxito evolutivo y se encuentran ampliamente difundidas entre las bacterias gramnegativas, en parte, probablemente, por su codificación plasmídica y la inclusión del determinante genético en el seno de un transposón. En algunas especies, como Escherichia coli, del 30% al 50% de los aislamientos clínicos poseen una betalactamasa de tipo TEM. En la actualidad hay descritos más de 40 tipos diferentes de TEM, lo que representa el 20% de todas las betalactamasas conocidas.

Aunque el origen de estas enzimas permanece oscuro, la evolución y diseminación de las betalactamasas plasmídicas de tipo TEM parecen ser la consecuencia directa de la evolución y el consumo de antibióticos betalactámicos. Los primeros betalactámicos (penicilinas, amino, carboxi y ureidopenicilinas, y las cefalosporinas de primera generación) seleccionaron bacterias portadoras de betalactamasas plasmídicas de tipo TEM originales (TEM-1 y TEM-2). En 1963 se identifica por vez primera una betalactamasa de tipo TEM, la TEM-1, en una cepa clínica aislada en Grecia (2). En 1969 se identifica la TEM-2 (3) y durante los 15 años siguientes no se encuentran nuevas TEM. El aumento en el consumo de betalactámicos originó la diseminación (diferentes plásmidos portadores, en diferentes cepas de la misma especie, en diferentes especies) de los genes que codificaban estas betalactamasas. Tras unos años, las betalactamasas de tipo TEM se hallaban ampliamente diseminadas en bacterias gramnegativas de interés clínico.

Después, en un periodo de tiempo relativamente corto (1978 a 1986) fueron desarrollados nuevos betalactámicos, como las cefalosporinas de tercera generación, los monobactames y los inhibidores suicidas. Las enzimas TEM-1 y TEM-2 eran incapaces de hidrolizar estos nuevos sustratos. Las TEM estaban ampliamente diseminadas y el resultado no se hizo esperar. Empezaron a aparecer bacterias que, al producir estas betalactamasas, eran resistentes a los nuevos antibióticos betalactámicos. En 1984 se describe la TEM-3 (4), una variante de TEM-2 (5) que contiene 3 cambios en su secuencia de aminoácidos y que es capaz de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación. Estas nuevas enzimas constituyen una nueva clase (cuya primera representante es la SHV-2, aislada un año antes) que se conoce con el nombre de betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado (grupo 2be de Bush, Jacoby y Medeiros). Durante los siguientes 6 o 7 años parece haberse producido una explosión de diversidad de betalactamasas de tipo TEM. Se aíslan y caracterizan más de 30 variantes de TEM-1 y TEM-2 que presentan el espectro de sustrato ampliado o una menor sensibilidad a los inhibidores suicidas.

Paralelamente se producen nuevos fenómenos:

1) Las bacterias asocian la producción de betalactamasas a mutaciones cromosómicas que, por ejemplo, disminuyen o anulan la producción de alguna porina específica.

2) Las bacterias aprenden a sobreproducir TEM (promotores más potentes, plásmidos con más copias). Esta sobreproducción permite la hidrólisis de sustratos para los que las enzimas de tipo TEM tienen baja actividad y, además, disminuye la efectividad de los inhibidores (al incrementarse el número de dianas alguna enzima es capaz de escapar a su acción).

3) Las bacterias combinan en una misma célula la producción de dos TEM diferentes (por ejemplo TEM-1 más TEM-27) (6), o de una TEM más otro tipo de betalactamasa, lo que permite tener una mejor tasa de hidrólisis combinada para muchos de los posibles sustratos. Desde el punto de vista evolutivo, este tercer fenómeno adaptativo plantea una interesante pregunta: ¿pueden las bacterias utilizar la diploidía (en este caso dos alelos diferentes del mismo gen) como medio para ensayar nuevas combinaciones de mutaciones sin peligro de perder la actividad protectora de la enzima original?

En resumen, la evolución de las betalactamasas de tipo TEM ha seguido, aparentemente, varios caminos: a) cuantitativo, que implica el aumento de la presencia de la enzima tanto en la población (diseminación de los genes mediante plásmidos y transposones) como en los individuos (aumento en la producción por mutaciones en el promotor o por aumento en el número de copias del plásmido portador); y b) cualitativo, que implica una especialización de la enzima en la hidrólisis de nuevos sustratos mediante la adquisición de mutaciones (7).

Las nuevas variantes de TEM-1 o TEM-2 con actividad hidrolítica sobre las cefalosporinas de tercera generación y los monobactames son el resultado de la presencia de un cambio, o la combinación de varios, en las posiciones 39, 104, 164, 237, 238, 240 y 265. Los cambios Glu104 »Lys, Arg164238 »Ser y Glu240 »Lys son capaces por sí mismos (en ausencia de otros) de conferir actividad sobre los citados betalactámicos (8-10). Además, la combinación en la misma molécula de más de uno de estos cambios supone, en la mayoría de los casos, un aumento sustancial en la actividad (mayor que la mera suma de las actividades conferidas por las mutaciones por separado). Los cambios Gln39 »Lys y Thr265 »Met se han considerado clásicamente como neutros en el sentido de que no modifican la actividad de las enzimas que los poseen (11). Sin embargo, estudios detallados indican que ambas mutaciones pueden modificar la actividad enzimática (7, 12, 13) y su capacidad de selección (Negri y Baquero, comunicación personal). Por último, el cambio Ala237 »Thr se ha descrito como causa, en ausencia de otros, del incremento en la actividad sobre las cefalosporinas (14). Estudios realizados en nuestro laboratorio muestran que la introducción mediante mutagénesis dirigida de dicho cambio en la molécula de TEM-1 no modifica de modo sustancial la actividad frente a las cefalosporinas de tercera generación (7). La introducción de la citada mutación en TEM-10 (variante con dos cambios: Ser164, Lys240) da lugar a TEM-5. La nueva variante confiere a la cepa portadora una resistencia a la cefotaxima que se ve incrementada en 4 veces con respecto a TEM-10 (15). Así, el efecto de los cambios de aminoácidos en las moléculas de TEM-1 y TEM-2 se debe interpretar en relación con las otras posibles modificaciones acompañantes y no como cambios aislados. Los cambios, considerados hasta el momento como neutros, pueden desempeñar un papel importante en la evolución de las betalactamasas de tipo TEM, actuando como mutaciones compensatorias de algunas deficiencias en la actividad originadas por otras mutaciones más activas. »Ser (o His), Gly

Pese a la gran diversidad de betalactamasas de espectro ampliado de tipo TEM, llama la atención que todas ellas sean el resultado de la combinación de sólo 7 cambios en la secuencia. Estudios de mutagénesis sobre diferentes regiones de la proteína muestran que existe un gran número de mutaciones capaces de incrementar la actividad, por ejemplo, sobre ceftazidima (16, 17). Pero muchas de esas mutaciones determinan una gran disminución de la actividad hidrolítica sobre otros betalactámicos. Sólo unas pocas son capaces de mantener un buen nivel de actividad frente a un número elevado de sustratos. La mayoría de éstas coincide con las encontradas en las TEM aisladas en cepas clínicas.

En el marco clínico, la situación pudo ser muy similar. El uso de los nuevos betalactámicos no fue seguido por un descenso sustancial en la utilización de los primitivos. Esta situación pudo crear un problema adaptativo a las bacterias entéricas con betalactamasas de tipo TEM. Debían enfrentarse de forma consecutiva a moléculas nuevas y antiguas. Así, las mutaciones que observamos en las TEM naturales son el resultado de la selección por diferentes agentes de forma alternante y no por un solo agente que actúa de manera uniforme.

A partir de 1990 comienzan a aislarse variantes de TEM con menor sensibilidad a los inhibidores suicidas de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam). Con estas nuevas variantes se inaugura un nuevo grupo en la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiros: el 2br. Tras el uso tentativo de varias denominaciones, en la actualidad parece ampliamente aceptado el nombre de IRT (Inhibitor Resistant TEM) para estas nuevas enzimas (18). De forma similar a lo acontecido con las TEM de espectro ampliado, las IRT muestran un rápido proceso de diversificación. En unos pocos años se han descrito 13 variantes moleculares, todas ellas resultado de un cambio, o de la combinación de varios cambios, en alguno de los aminoácidos siguientes: Met69, Trp165, Met182, Arg244, Arg275 y Asn276.

Durante los últimos 6 años las IRT y las TEM de espectro ampliado han coexistido sin mezclar sus mutaciones. De hecho, la inclusión en la misma molécula de enzima de los dos tipos de mutaciones confería solamente el fenotipo de ampliación del espectro, perdiéndose la resistencia a los inhibidores. Los microorganismos, seguramente los mejores ingenieros genéticos, es muy probable que encuentren el modo de solucionar esta incompatibilidad (posiblemente por mutaciones compensatorias).

Bibliografía

  1. Bush, K., Jacoby, G.A., Medeiros, A.A. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39.
  2. Datta, N., Kontomichalou, P. Nature 1965; 208: 239-241.
  3. Lowbury, E.J.L., Kidson, A., Lilly, H,A., Ayliffe, G.A.J., Jones, R.J. Lancet 1969; ii: 448-452.
  4. Brun-Buisson, C., Legrand, P., Philippon, A., Montravers, F., Ansquer, M., Duval, J. Lancet 1987; 2: 302-306.
  5. Sougakoff, W., Petit, A., Goussard, S., Sirot, D., Bure, A., Courvalin, P. Gene 1989; 78: 339-348.
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  7. Baquero, F., Blázquez, J. Simposium: New horizons in betalactamases. 6th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 1993.
  8. Blázquez, J., Morosini, M.I., Negri, M.C., González-Leiza, M., Baquero, F. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 145-149.
  9. Chanal, C., Poupart, M.C., Sirot, D. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 1817-1820.
  10. Sowek, J.A., Singer, S.B., Ohringer, S., Malley, M.F., Dougherty, T.J., Gougoutas, J.Z., Bush, K. Biochem 1991; 30: 337-342.
  11. Knox, J. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2593-2601.
  12. Chaïbi, E.B., Farzaneh, S., Péduzzi, J., Barthélémy, M., Labia, R. FEMS Microbiol Lett 1996; 143: 121-125.
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  15. Blázquez, J., Sánchez, L., Negri, M.C., Morosini, M.I., Gómez-Gómez, J.M., Baquero, F., Valencia, A. 36 ICAAC, New Orleans, USA 1996; Abst.
  16. Palzkill, T., Botstein, D. J Bacteriol 1992; 174: 5237-5243.
  17. Venkatachalam, K.V., Huang, W., LaRocco, M., Palzkill, T. J Biol Chem 1994; 269: 23444-23450.
  18. Blázquez, J., Baquero, M.R., Cantón, R., Alós, R., Baquero, F. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 2059-2063.

 

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Epidemiología de las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado.

C. Ardanuy

Servicio de Microbiología, Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge, L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona.

La incorporación a la terapéutica de las cefalosporinas de tercera generación y de los monobactames, resistentes a la hidrólisis por betalactamasas clásicas, supuso un importante avance en el tratamiento de las infecciones causadas por enterobacterias. En 1983 se detectaron en Alemania los primeros aislamientos clínicos de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli resistentes a estos antibióticos por producción de una betalactamasa plasmídica transferible por conjugación (1, 2). Estas enzimas fueron denominadas betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado (BLEA) y corresponden al grupo 2be de la clasificación de Bush y cols. (3).

Las BLEA derivan de las betalactamasas plasmídicas clásicas por mutaciones concretas en los genes que las codifican, originando cambios en su secuencia de aminoácidos. Estas mutaciones han dado lugar a una gran variedad de enzimas (de TEM-3 a TEM-29 y de SHV-2 a SHV-7) (3, 4).

A finales de la década de 1980 se describen en Francia los primeros brotes nosocomiales producidos por cepas de K. pneumoniae productoras de BLEA (5, 6). Desde entonces se han documentado numerosos brotes nosocomiales por todo el mundo causados por diferentes especies de enterobacterias con este patrón de resistencia enzimática (7, 8). Un estudio reciente realizado en Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) de 10 países europeos, demostró que un 22,8% de los aislamientos de Klebsiella sp. eran productores de BLEA, siendo K. pneumoniae la especie más importante (9).

La producción de estas enzimas confiere resistencia a penicilinas, cefalosporinas y monobactames. Los carbapenemes y las cefamicinas no son hidrolizados por este grupo de betalactamasas. Las combinaciones de penicilinas con inhibidores de betalactamasas pueden ser activas, aunque se han descrito casos de resistencia por hiperproducción de BLEA y por producción conjunta de BLEA y SHV-1 (10, 11).

Los plásmidos que codifican la producción de estas enzimas se transfieren fácilmente entre distintas especies bacterianas por conjugación, y además pueden llevar asociados mecanismos de resistencia a otros grupos de antibióticos, lo que dificulta el tratamiento de las infecciones acusadas por estos microoganismos (12).

El hallazgo de enterobacterias productoras de BLEA puede ser esporádico, sin relación clonal, o bien dar lugar a brotes nosocomiales generalmente originados por un mismo clon bacteriano. Estas epidemias suelen afectar a un número reducido de pacientes, aunque también pueden ser de mayor extensión y originar una situación endémica.

Los brotes nosocomiales causados por enterobacterias productoras de BLEA pueden deberse a la diseminación horizontal de un plásmido por conjugación entre diferentes especies bacterianas, o bien a la diseminación de un clon bacteriano multirresistente. Estas epidemias intrahospitalarias surgen principalmente en las UCI y se asocian a un consumo elevado de cefalosporinas de tercera generación. La colonización fecal es importante porque actúa de reservorio de estos microrganismos y facilita la transmisión de esta resistencia a otras enterobacterias. La transmisión horizontal de paciente a paciente mediante la manipulación por el personal sanitario es la forma más frecuente de diseminación de una cepa epidémica (6, 7). Los factores de riesgo asociados a infección y/o colonización por estos microorganismos son: estancia prolongada en UCI, cateterización arterial o urinaria y consumo de antibióticos.

En el control de estos brotes han resultado eficaces la restricción del uso de cefalosporinas de tercera generación, la educación del personal sanitario y la aplicación de medidas de barrera (aislamiento cutáneo) (8). La descontaminación intestinal es una medida cuestionada, ya que puede seleccionar otros microorganismos multirresistentes.

Con los criterios del NCCLS, algunos de los microorganismos productores de BLEA podrían considerarse sensibles a las cefalosporinas de tercera generación, (7) por lo que para detectar la producción de BLEA deben utilizarse los métodos de la sinergia de doble difusión con disco (entre cefalosporinas de tercera generación y ácido clavulánico) o el método de difusión de E-test (ceftazidima y ceftazidima/ácido clavulánico).

En nuestra experiencia, durante una epidemia de origen clonal causada por K. pneumoniae productora de BLEA se vieron afectados 145 pacientes, de los que el 69,6% estaban ingresados en la UCI (13). La cepa epidémica presentaba resistencia a cefalosporinas de tercera generación, aztreonam, gentamicina y ciprofloxacino, y producía dos tipos de BLEA con pI de 7,6 y 8,2. En tres estudios de incidencia de colonización fecal por K. pneumoniae productor de BLEA realizados en las UCI de nuestro hospital, se detectó en el 41% de los pacientes en 1993, en el 35,6% en 1994 y en el 5% en 1995 (14). La eradicación del brote se consiguió mediante la aplicación de medidas de barrera, la restricción en el uso de cefalosporinas de tercera generación en las UCI y el seguimiento diario de los casos nuevos.

Bibliografía

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  14. Peña, C., Pujol, M., Ricart, A., Ardanuy, C., Ayats, J., Liñares, J., Garrigosa, F., Ariza, J., Gudiol, F. Risk factors for fecal carriage of Klebsiella pneumoniae producing extended spectrum betalactamase (ESBL-KP) in the intensive care unit. J Hosp Infect (en prensa).

 

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Novedades en la relación entre inhibidores de betalactamasas y betalactámicos.

M.A. Torrellas

Dpto. Investigación Clínica, SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Madrid.

Para el estudio de la actividad in vivo de un antimicrobiano hay que distinguir los factores bacterianos que contribuyen directamente a la virulencia bacteriana, como la tasa de crecimiento bacteriano y productos metabólicos (enzimas degradantes de antibióticos), de la presencia de productos exógenos como antibióticos y/o inhibidores de las enzimas hidrolizantes y los factores del huésped (1).

Con objeto de realizar una aproximación novedosa al estudio de las interacciones dinámicas entre inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico) y betalactámicos (amoxicilina), revisaremos los estudios realizados acerca del efecto que sobre la viabilidad bacteriana y la actividad enzimática de dos cepas tipo, productoras de betalactamasas, puede tener la exposición continua de concentraciones de ácido clavulánico y/o de amoxicilina similares a las obtenidas en suero humano de voluntarios sanos tras una dosis única oral de 875 mg de amoxicilina/125 mg de ácido clavulánico (2, 3).

Para ello se utilizó un modelo in vitro de simulación farmacodinámica continua que tiene en cuenta el efecto carry-over a lo largo de 12 horas (4).

Los resultados obtenidos se pueden concretar en los siguientes puntos:

1) Concentraciones fisiológicas de ácido clavulánico incrementan el tiempo de generación celular de ambas cepas.

2) El ácido clavuláncio inhibe la actividad de las betalactamasas de ambas cepas durante 12 horas, a pesar de que a partir de las 6 horas no existen concentraciones apreciables en suero en la simulación farmacodinámica (5, 6).

Cuando se estudia el efecto combinado de amoxicilina/clavulánico en simulación farmacodinámica se obtiene una reducción del 98% de un inóculo inicial de 8,5 x 106 UFC/ml de Staphylococcus aureus a las 12 h a pesar de la no existencia de ácido clavulánico a partir de las 6 h y de amoxicilina a partir de las 8 h (7).

Fenómenos como el PLIE (tiempo de recuperación de la actividad betalactamasa con respecto a un control, tras la desaparición del ácido clavulánico), el PAE (tiempo de supresión del crecimiento bacteriano con respecto al control tras la exposición al antimicrobiano) y la prolongación del PAE por concentraciones subinhibitorias pudieran explicar estas observaciones.

Por último, indicar que el estudio de los efectos in vitro de simulaciones farmacodinámicas de ácido clavulánico en la viabilidad y en la actividad betalactamasa bacteriana, junto con el efecto combinado del ácido clavulánico con el antibiótico, ayudaría a explicar la actividad antimicrobiana in vivo. Estos resultados pueden tener implicaciones explicativas en esquemas de dosificación terapéutica.

Bibliografía

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  4. Balcabao, I.P., Aguilar, L., Martín, M., García, Y., Dal-Ré, R., Prieto, J. Bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae of amoxicillin and cefotaxime physiological concentrations: In vitro pharmacodynamic simulation. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40 (12).
  5. Martín, M., Aguilar, L., Balcabao, I.P., Gómez-Lus, M.L., Dal-Ré, R., Prieto, J. In vitro pharmacodynamic simulation of clavulanic acid concentrations on Staphylococcus aureus and Haemophilus influenzae betalactamase activity. J Antimicrob Chemother (en prensa).
  6. Balcabao, I.P., Prieto, J., Aguilar, L., Martín, M., Dal-Ré, R. Comparative in vitro effects of clavulanic acid (CA) physiological concentrations on Staphylococcus aureus (SA) and Haemophilus influenzae (HI) viability and betalactamase activity. 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Vienna 1995; Abstract Nº 531.
  7. Balcabao, I.P., Prieto, J., Aguilar, L., Martín, M., Dal-Ré, R. Comparative in vitro effects of amoxicillin-clavulanic acid (AC) physiological concentrations on Staphylococcus aureus (SA) viability and betalactamase activity. 66th International Congress for Infectious Diseases, Prague 1994; Abstract Nº 123

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Cefalosporinas inducibles:de AmpC a las cefamicinas plasmídicas

L. Martínez Martínez

Dpto. de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla.

CEFALOSPORINASAS CROMOSÓMICAS

Prácticamente todas las bacterias gramnegativas poseen una cefalosporinasa cromosómica. El tipo de enzima varía en función del microorganismo: algunos producen enzimas de clase A (de forma constitutiva, como Klebsiella o Bacteroides fragilis, o de forma inducible, como Citrobacter diversus o Proteus vulgaris), pero más frecuentemente la betalactamasa es de clase C (BLS-C). Escherichia coli y Shigella sonneii producen una baja cantidad no inducible de enzima, mientras que Enterobacter cloacae, E. aerogenes, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia sp., Providencia sp., Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gramnegativos producen una betalactamasa inducible.

Las BLS-C (clase I de Richmond-Sykes; grupo 1 de Bush-Jacoby-Medeiros) son enzimas con un sitio activo de serina, de unos 30-42 kD, con pI básicos, fundamentalmente cefalosporinasas, aunque también inactivan penicilinas. No se inhiben por ácido clavulánico, pero sí por cloxacilina.

La importancia clínica de las BLS-C cromosómicas depende de dos procesos relacionados, pero conceptualmente muy diferentes: inducción y desrepresión. La inducción es la activación transitoria, reversible, de la síntesis de betalactamasa cromosómica en respuesta a la presencia de sustancias (inductores) entre las que se incluyen los betalactámicos y algunos compuestos orgánicos. La cantidad de enzima producida depende del tipo de inductor, de la cantidad de éste y del tiempo de inducción. Los mejores inductores son las cefamicinas (más cefoxitina y bastante menos cefotetan) y los carbapenemes (más imipenem que meropenem). Tanto ampicilina como cefaloridina son muy lábiles (se degrada una gran cantidad de moléculas por unidad de tiempo) e inductoras fuertes de la enzima, con lo que determinan su autoinactivación. Las cefalosporinas de segunda y tercera generación, aztreonam, las ureidopenicilinas y las carboxipenicilinas son también lábiles (en grado variable, dependiendo del compuesto), pero débiles inductoras. Cefepima y cefpiroma son más estables a la hidrólisis que las cefalosporinas de tercera generación, y poco inductoras. Imipenem es un fuerte inductor, pero al ser muy estable a la acción hidrolítica de la enzima (incluso en caso de desrepresión) pierde poca actividad, a no ser que exista un mecanismo de resistencia adicional (por ejemplo disminución de la permeabilidad). Meropenem es un peor inductor y aún más estable a la enzima. Los inhibidores de betalactamasas plasmídicas poseen diferente actividad como inductores de BLS-C, pero la significación clínica de la inducción por este tipo de compuestos es poco conocida porque sobreviene a concentraciones de inhibidor difícilmente alcanzables in vivo.

La desrepresión es un proceso de producción permanente de la enzima, con independencia de la presencia o no de betalactámico. La desrepresión de la enzima puede ser parcial (cuando la cantidad de enzima producida aún puede aumentarse en presencia de un inductor) o total. En P. aeruginosa aparecen mutantes parcialmente desreprimidas a una frecuencia de aproximadamente 10-7, y mutantes totalmente desreprimidas en torno a 10-9, mientras que en Enterobacter sp. aparecen mutantes totalmente desreprimidas con una frecuencia entre 10-5 y 10-7.

La mayoría de los estudios sobre la base genética del proceso de inducción se han realizado en Citrobacter freundii y en Enterobacter cloacae. El gen estructural es ampC y está sometido al control de AmpR. La proteína AmpR actúa como represora de la transcripción de ampC en condiciones basales (de no inducción) y como activadora de la transcripción en condiciones de inducción. El ampR pasa de la forma represora a la forma activadora cuando AmpR interacciona en el citoplasma bacteriano con un producto soluble derivado de la degradación/reciclado del peptidoglucano (el compuesto más importante en este sentido es el anhidro-acetil-murámico-l-lisina-d-glutámico-meso-diaminopimélico, NAMT), cuyos niveles aumentan, presumiblemente, como consecuencia de la inhibición de las proteínas fijadoras de penicilina por parte de los betalactámicos (inductores). Hay al menos otros tres genes que intervienen en el control de la inducción de AmpC: ampD, ampE y ampG. El ampD produce una proteína soluble que actúa como amidasa degradando el NAMT, disminuyendo la concentración intracitoplásmica de este metabolito. Las mutaciones en ampD (las más importantes en clínica) dan lugar a la desrepresión o la hiperinducibilidad de la síntesis de AmpC. La AmpG es una proteína de membrana que actúa como transportador del NAMT desde el periplasma al interior del citoplasma bacteriano y contribuye a que los niveles de este metabolito en el citoplasma se eleven. La AmpE es una proteína citoplásmica que probablemente actúe como un sensor de betalactámicos, contribuyendo a aumentar el efecto represor de AmpD, pero parece ser indispensable en todo el proceso y su papel no ha sido aclarado aún convincentemente. Se han descrito otros genes (pbpA, ftsZ) relacionados también con el control de la producción de AmpC inducible, pero el mecanismo implicado es desconocido.

En E. coli y S. sonnei la expresión de AmpC es constitutiva, y en condiciones normales se producen cantidades mínimas de enzima. En E. coli no existe ampR, el promotor de ampC es poco eficaz y además existe un atenuador entre el promotor y el gen estructural. Se han descrito cepas de E. coli hiperproductoras de AmpC por amplificación del gen o por mutaciones que afectan al atenuador o al promotor de ampC.

Las enterobacterias con AmpC inducible producen cantidades escasas de enzima en ausencia de inductor. Tanto las cepas inducibles como las desreprimidas de Enterobacter, C. freundii, M. morganii y S. marcescens son resistentes a ampicilina y cefalosporinas de corto espectro; las dos primeras especies son también resistentes a cefoxitina, pero este antimicrobiano es moderadamente eficaz frente a M. morganii, S. marcescens y Providencia sp. Las ureido y carboxipenicilinas y las cefalosporinas de tercera generación son activas frente a cepas inducibles, pero no frente a las cepas desreprimidas. Los carbapenemes y las cefalosporinas de cuarta generación son, en general, activos frente a cepas desreprimidas, excluyendo las cepas desreprimidas de Enterobacter que no expresan porinas. En P. aeruginosa el grado de resistencia depende de la cantidad de enzima producida por el proceso de inducción/desrepresión: las ureidopenicilinas se afectan incluso con pequeñas cantidades de enzima, pero las cefalosporinas de cuarta generación y la carbenicilina sólo se afectan de forma significativa cuando existe una desrepresión total; la resistencia a los carbapenemes en esta especie depende también de alteraciones de la permeabilidad y (al menos para algunos compuestos) de la existencia de bombas de eflujo.

Se calcula que aparecen mutantes desreprimidas en un 7% a 40% de los pacientes que sufren infección por agentes con AmpC inducible. En P. aeruginosa se ha observado selección de cepas desreprimidas en relación con el uso de ureidopenicilinas, piperacilina y cefalosporinas de tercera generación. En las enterobacterias esta selección depende fundamentalmente del empleo de cefalosporinas de tercera generación. En un 25% a 75% de aquellos pacientes en que aparecen mutantes resistentes sobreviene un fallo terapéutico, con más frecuencia en infecciones respiratorias u óseas que en infecciones urinarias (probablemente por la alta concentración de fármaco alcanzada en el tracto urinario).

Cefamicinasas Plasmídicas

Las betalactamasas codificadas por plásmidos tienen, en general, propiedades diferentes de las enzimas de tipo cromosómico, pero en algunos casos es difícil establecer si una enzima debe considerarse cromosómica o plasmídica: SHV-1 es una betalactamasa muy comúnmente codificada por plásmidos, pero también por el cromosoma de K. pneumoniae. Se ha demostrado una relación evolutiva entre plásmidos que codifican enzimas tipo TEM y la enzima cromosómica de K. pneumoniae LEN-1, y que las enzimas plasmídicas MEN-1 y FEC-1 guardan una estrecha relación con la betalactamasa cromosómica de clase A de K. oxytoca.

La mayoría de las betalactamasas codificadas por plásmidos no confieren resistencia a las cefamicinas. Esta característica ayuda a reconocer fenotípicamente las cepas productoras de betalactamasas plasmídicas de espectro extendido tradicionales. En los últimos años, sin embargo, se han descrito betalactamasas plasmídicas que confieren resistencia no sólo a cefalosporinas de tercera generación sino también a cefamicinas, por lo que se conocen como cefamicinasas plasmídicas. La mayor parte de estas enzimas se han descrito en K. pneumoniae, aunque también se han identificado en E. coli y en Achromobacter sp. Las representantes mejor caracterizadas son MIR-1, MOX-1, CMY-1, CMY-2, BIL-1, LAT-1 y FOX-1 y algunas otras enzimas recientemente identificadas todavía sin denominación específica.

Las cepas con cefamicinasas plasmídicas se han descrito tanto de forma epidémica como ocasional. Los plásmidos implicados son tanto conjugativos como no conjugativos (incluso para el mismo tipo de enzima) y de muy variado tamaño. Este tipo de enzimas suelen tener un pI básico, incluso superior a 10, y confieren resistencia a cefamicinas y cefalosporinas (incluidas las de tercera generación), pero no a carbapenemes. No se inhiben por ácido clavulánico pero sí por aztreonam, lo que las asemeja a las BLS-C anteriormente comentadas. Se conocen las bases genéticas que controlan la producción de estas enzimas en bastantes casos y se ha comprobado que el gen estructural tiene una alta homología con AmpC de C. freundii (en la mayoría de los casos), de E. cloacae o de P. aeruginosa. Dicho gen estructural no se acompaña de un gen equivalente a ampR y en consecuencia la enzima se produce de forma constitutiva.

El descubrimiento de las cefamicinasas cromosómicas podría sugerir la posibilidad de que los distintos tipos de enzimas codificadas por plásmidos tengan un origen cromosómico, aunque en la actualidad desconozcamos el organismo que inicialmente sirvió como fuente para la transmisión de la información del cromosoma al plásmido.

Bibliografía

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  3. Lindberg, F., Normark, S. Contribution of chromosomal betalactamases to betalactam resistance in enterobacteria. Rev Infect Dis 1986; 8 (Suppl. 3): S292-S304.
  4. Papanicolau, G., Medeiros, A.A., Jacoby, G.A. Novel plasmid-mediated betalactamase (MIR-1) conferring resistance to oxyimino- and a-methoxy betalactams in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 2200-2209.
  5. Bennett, P.M., Chopra, I. Molecular basis of betalactam induction in bacteria. Antimicrob Agents Chemother 1993; 153-158.
  6. González-Leiza, M., Pérez-Díaz, J.C., Ayala, J., Casella, J.M., Martínez-Beltrán, J., Bush, K., Baquero, F. Gene sequence and biochemical characterization of FOX-1 from Klebsiella pneumoniae, a new AmpC-type plasmid-mediated betalactamase with two molecular variants. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 2150-2157.

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Carbapenemasas.¿Un nuevo reto para la antibioterapia?

R. Cantón

Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

Los carbapenemes, representados en España por el imipenem y más recientemente por el meropenem, constituyen el grupo de antibióticos betalactámicos más estables a la hidrólisis por las betalactamasas. Son resistentes a la acción de la mayoría de estas enzimas, incluyendo AmpC y las betalactamasas plasmídicas de espectro ampliado de tipo TEM, SHV y OXA. Durante años, la única carbapenemasa conocida fue la descrita en Bacillus cereus (betalactamasa II), considerándose una curiosidad de laboratorio. Posteriormente se comprobó que Stenotrophomonas maltophilia, Chryseobacteriun odoratum, Legionella gormanii y algunos aislamientos de Bacteroides fragilis producían también enzimas de carácter cromosómico capaces de hidrolizar estos compuestos. La reciente identificación y caracterización de carbapenemasas plasmídicas en Pseudomonas aeruginosa, en diferentes especies de Enterobacteriaceae y en Acinetobacter ha generado un mayor interés por su estudio y puede suponer un nuevo reto para la antibioterapia.

La resistencia a los carbapenemes no está determinada en exclusiva por la producción de carbapenemasas, ya que existen al menos otros tres mecanismos que pueden afectar a su actividad: pérdida de porinas específicas, bombeo o expulsión del antibiótico y modificaciones en las proteínas fijadoras de penicilina (PBP). Con la excepción de P. aeruginosa y otros bacilos gramnegativos no fermentadores, la resistencia a los carbapenemes es todavía infrecuente, y en algunos casos es necesaria la superposición de más de un mecanismo para que esta resistencia tenga relevancia clínica.

Atendiendo a la clasificación molecular de Ambler, las carbapenemasas pueden estructurarse en dos grupos (Tabla 1). El primero está representado por las de clase B (grupo 3 de la clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros), son metaloenzimas y requieren zinc para su actuación. Son inhibidas por EDTA, pero no por ácido clavulánico. Estas enzimas también hidrolizan las penicilinas y cefalosporinas, incluyendo las cefamicinas. Sin embargo, la ticarcilina y el aztreonam son sustratos débiles. Las metaloenzimas son generalmente de naturaleza cromosómica, aunque recientemente se han asociados a plásmidos conjugativos. Son inducibles y se han encontrado en S. maltophilia (betalactamasa L1), Aeromonas sp. (A2, CphA), B. cepacia (PCM-1) y B. fragilis (CcrA). Por el contrario, las plasmídicas de este grupo son enzimas constitutivas y se han descrito en S. marcescens (IMP-1), P. aeruginosa y B. fragilis.

Tabla1.Carbapenemasas.

  Grupo     Inhibición por    
Clase Bush-Jacoby    
       
Ambler Medeiros Enzima pI CLAV EDTA Localización * Microorganismos
B 3 CcrA 4,5-5,2 – + Crm/PI B. fragilis
      5,8 – + Crm C. odoratum
    L1 6,9 – + Crm S. maltophilia
    CphA 8,0-8,4 – + Crm Aeromonas sp.
    PCM-1 8,8 – + Crm B. cepacia
    "Watanabe" 9,0 – + PI P. aeruginosa
    IMP-1 >9,5 – + Crm/PI S. marcescens
              P. aeruginosa
              K. nuemoniae
    PCM-1 8,8 +/- + Crm B. cepacia
    ARI-1 6,6 – + PI A. baumannii
    AbRC-1 6,7 – + PI A. baumannii
A 2f NMC-A 6,9 +/- – Crm E. cloacae
    IMI-1 7,0 +/- – Crm E. cloacae
    Sme-1 9,7 +/- – Crm S. marcenses

*Crm: localización cromosómica; PI: localización plasmídica.

Las carbapenemasas descritas en S. marcescens y P. aeruginosa hidrolizan a imipenem y meropenem con una eficacia similar, si bien el grado de resistencia es discretamente mayor frente al meropenem, particularmente en P. aeruginosa. Asimismo, las carbapenemasas cromosómicas y plasmídicas de B. fragilis hidrolizan algo mejor el meropenem que el imipenem. El gen cromosómico (cfiA o ccrA) puede ser silente y expresarse con diferentes grados, dependiendo de la presencia de un elemento de inserción en el codón de iniciación del gen que codifica la betalactamasa.

La frecuencia real de aislamientos productores de carbapenemasas de clase B no es del todo conocida: casi el 100% de los aislamientos de S. maltophilia producen la metaloenzima L1; CphA está muy difundida entre las especies clínicas de Aeromonas, aunque es necesario un inóculo elevado (108 x UFC/ml) para demostrar un incremento en los valores de CMI del imipenem; y algunos autores han sugerido que todos los aislamientos de B. cepacia producen, además de una cefalosporinasa, una carbapenemasa poco eficiente, y que la expresión de estas enzimas es poco frecuente en B. fragilis (<3%). Asimismo, la descripción de las carbapenemasas en Acinetobacter sp. es extremadamente rara; sólo se han descrito las enzimas AbRc-1 en dos cepas aisladas en Francia y ARI-1 en otro aislamiento en Gran Bretaña. Ambas son de carácter plasmídico, habiéndose demostrado para ARI-1 la transferencia por conjugación a otras especies de Acinetobacter. Especial atención requieren los datos publicados acerca de la presencia de IMP-1 en P. aeruginosa en Japón (0,4% del total de aislamientos estudiados). Esta enzima, en muchos casos, es de carácter plasmídico y puede transferirse por electroporación a otras cepas de P. aeruginosa y Escherichia coli. La IMP-1 también se ha encontrado en Japón en S. marcescens (3,8%) y en Klebsiella pneumoniae, microorganismo considerado como vector "ideal" de plásmidos de resistencia. Asimismo, en el primer caso pudo transferirse por conjugación a E. coli la resistencia al imipenem.

El segundo grupo de enzimas que hidrolizan a los carbapenemes son serina betalactamasas de clase A (grupo 2f de Bush-Jacoby-Medeiros). A diferencia de las de clase B, son parcialmente inhibidas por el ácido clavulánico pero no por el EDTA. Estas enzimas son penicilinasas pero también hidrolizan eficazmente a los carbapenemes y al aztreonam. Por el contrario, hidrolizan débilmente a las cefalosporinas y, con la excepción de la enzima NMC-A, no hidrolizan a la cefoxitina. Por el momento sólo se han descrito tres carbapenemasas de clase A, todas ellas en Enterobacteriaceae: Sme-1 en dos cepas de S. marcescens aisladas en Inglaterra en 1982, IMI-1 en dos aislamientos de Enterobacter cloacae en Califomia en 1984, y NMC-A en una sola cepa de E. cloacae en París en 1990. Todas son inducibles, no transferibles y, al contrario que las carbapenemasas de clase B, la hidrólisis del imipenem es menor que la del meropenem. La producción de NMC-A y Sme-1 está controlada por reguladores de la familia LysR, NmcR y SmeR, respectivamente. Estas proteínas son reguladores positivos débiles estructuralmente relacionados con la proteína AmpR del sistema de regulación de la cefalosporinasa AmpC. Sin embargo, a diferencia del sistema AmpR-AmpC, actúan como inductores débiles tanto en ausencia como en presencia de antibióticos betalactámicos. Una diferente carbapenemasa de clase A se ha descrito de forma esporádica en Bacteroides distasonis, pero en éste la resistencia a los carbapenemes depende también de mecanismos relacionados con la permeabilidad.

En conclusión, a pesar del creciente uso de los carbapenemes, la mayoría de los bacilos gramnegativos continúan siendo sensibles a estos compuestos. En los aislamientos resistentes coexisten con frecuencia diferentes mecanismos para que la resistencia a los carbapenemes tenga relevancia clínica. La resistencia mediada por betalactamasas se debeesencialmente a metaloenzimas en patógenos de interés creciente (S. maltophilia y B. cepacia) y son raramente encontradas en Bacteroides y Enterobacteriaceae. Asimismo, las carbapenemasas de clase A se han encontrado ocasionalmente en E. cloacae y S. marcescens. La localización plasmídica de algunas metaloenzimas en P. aeruginosa, S. marcescens y K. pneumoniae, particularmente en países con una amplia utilización de carbapenemes, puede incidir en una mayor diseminación de la resistencia a estos antimicrobianos. Por ello, es urgente la investigación de nuevos betalactámicos que soslayen la resistencia a los carbapenemes, en particular la debida a carbapenemasas.

Bibliografía

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Aspectos metodol&oaute;gicos del estudio de las betalactamasas: del fenotipo al genotipo.

J. Vila

Laboratorio de Microbiología, Hospital Clínico y Provincial, Barcelona.

Entre los mecanismos de resistencia a los antibióticos betalactámicos que las bacterias pueden presentar, sin duda alguna la síntesis de betalactamasas es el más común. Dado que la resistencia a los betalactámicos puede deberse a otros mecanismos además de a las betalactamasas, la primera aproximación para conocer la posible implicación de éstas en la resistencia será el análisis detallado del patrón de sensibilidad a los betalactámicos según al antibiograma y la detección de la actividad betalactamasa. En la evaluación de la resistencia a los antibióticos betalactámicos, el análisis fenotípico de los patrones de resistencia puede representar en algunos casos poder predecir la posible implicación de una betalactamasa determinada. La interpretación de los fenotipos de resistencia a betalactámicos se basa en comparar los aislamientos clínicos con un determinado perfil de resistencia con el prototipo de bacteria sensible perteneciente a la misma especie. Para obtener un fenotipo de resistencia que permita predecir la presencia de alguna betalactamasa deberíamos incluir en el antibiograma, por lo menos:

1) La sensibilidad a penicilinas con y sin inhibidor de betalactamasas.

2) La ceftazidima, que es el mejor indicador de betalactamasas de espectro ampliado (BLEA).

3) La cefoxitina, que es un buen indicador de betalactamasas inducibles en Enterobacter sp. y Citrobacter sp., y ayuda a comprobar si una Klebsiella posee una BLEA o una betalactamasa AmpC.

4) Un carbapenem, el cual escapa a la resistencia mediada por la mayoría de las betalactamasas.

También es preferible detectar la CMI de estos betalactámicos en lugar de realizar el clásico antibiograma disco-placa. Sin embargo, existe una serie de limitaciones del antibiograma como sistema para predecir el tipo de betalactamasa, tales como:

1) No poder utilizar este sistema para microorganismos en que la relación entre antibiograma y mecanismos de resistencia no está bien establecida.

2) Las cepas bacterianas con una expresión de la enzima excepcionalmente elevada o escasa pueden presentar comportamientos anómalos, especialmente con la combinación de inhibidores de betalactamasas.

3) La resistencia intrínseca de algunas especies a los antibióticos betalactámicos puede modificar el fenotipo conferido por la misma betalactamasa.

4) La predicción falla cuando el aislamiento clínico estudiado presenta varios mecanismos de resistencia o más de un tipo de betalactamasas.

Diversos ensayos se han utilizado para constatar la producción de betalactamasas. Los procedimientos más comúnmente utilizados en laboratorios clínicos incluyen los que utilizan una cefalosporina cromogénica, el acidimétrico y el yodométrico. Todos ellos se basan en la detección visual del producto final de la hidrólisis de un betalactámico por acción de la betalactamasa, mediante una reacción colorimétrica. No todos los métodos son útiles para la detección de betalactamasas en cualquier bacteria. De todos ellos el más utilizado es el de la nitrocefina (cefalosporina cromogénica). Este método, aunque caro, permite detectar la mayoría de betalactamasas conocidas. Para algunas bacterias existe una correlación directa entre producción de betalactamasas y resistencia a antibióticos betalactámicos específicos, por ejemplo Haemophilus influenzae y la resistencia a ampicilina. Sin embargo, para otros microorganismos, tales como las enterobacterias o Pseudomonas, la producción de betalactamasas no puede predecir totalmente la resistencia a varios antibióticos betalactámicos. El desarrollo de resistencia a diversos antibióticos betalactámicos es un problema en algunos bacilos gramnegativos, como Enterobacter sp., Citrobacter sp., etc., que poseen una betalactamasa cromosómica inducible. Se ha comprobado que en el 14% y el 65% de los pacientes infectados con estos microorganismos, la bacteria desarrolla resistencia. Para detectar la capacidad de producir una betalactamasa cromosómica inducible se ha diseñado una prueba muy simple que consiste en colocar un disco que contiene un inductor débil (cefotaxima o cefamandol) cerca de un disco que contiene un inductor fuerte (cefoxitina). La inducción se detecta por la deformación del halo de inhibición del inductor débil en la zona cercana al disco que contiene el inductor fuerte. Sin embargo, la sensibilidad de este método comparado con un ensayo directo de inducción es del 80%. Otro ensayo biológico similar al descrito anteriormente nos permite detectar la producción de BLEA cuando los aislamientos clínicos presentan una sensibilidad reducida a ceftazidima. Para ello se utiliza un disco de ceftazidima y otro de amoxicilina más ácido clavulánico. Cuando la zona de inhibición de la ceftazidima se ve aumentada por la presencia del ácido clavulánico, se puede inferir la presencia de BLEA.

Actualmente es frecuente encontrar microorganismos que producen tres o cuatro betalactamasas. Cuando varias betalactamasas son producidas en el mismo microorganismo, las propiedades biológicas de éste reflejarán una compleja mezcla de parámetros debido a la variedad de propiedades cinéticas de las diversas enzimas y a las cantidades relativas de cada una. Por ejemplo, si una BLEA es producida en un microorganismo que también posee un alto grado de expresión de una betalactamasa del grupo 1, el microorganismo no será altamente sensible a los efectos del ácido clavulánico. Por ello, organismos productores de diversas betalactamasas pueden ser más difíciles de identificar como organismos que producen BLEA. La determinación del punto isoeléctrico (pI) es un método ampliamente utilizado para la diferenciación de las betalactamasas. Mediante este método podemos comprobar si un microorganismo está produciendo una o varias betalactamasas e identificarla(s) mediante comparación con enzimas de cepas de referencia. Sin embargo, un problema potencial en la utilización de este método es que las isoenzimas con una sustitución en un único aminoácido que no genera un cambio sustancial en el perfil del sustrato se detectarán en el futuro con mayor frecuencia, por lo que una diferencia en el pI puede, en algunos casos, ser inadecuada para describir dos enzimas como diferentes.

Existen en la actualidad, dentro de la amplia variedad de betalactamasas, algunas con sólo ligeras diferencias en su punto isoeléctrico. Por ello, su identificación mediante isoelectroenfoque puede ser difícil y quizás motivo de error. Se han desarrollado diversas sondas de DNA para detectar betalactamasas mediante hibridación y así disponer de un método alternativo al isoelectroenfoque. Como sondas de DNA se han utilizado: 1) fragmentos de DNA del gen que se quiere detectar, aunque algunas veces pueden presentar hibridación cruzada con genes de otras betalactamasas no relacionadas; y 2) oligonucleótidos, que son mucho más específicos y permiten discriminar entre genes que se diferencian en un único nucleótido (por ejemplo TEM-1 y TEM-2). La principal desventaja de estas técnicas de hibridación es su complejidad de realización. Para soslayar este inconveniente se ha diseñado una serie de primers específicos que permiten detectar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las familias más importantes de betalactamasas (por ejemplo TEM, SHV). En algunos casos, la diferencia entre los miembros de estas familias estriba exclusivamente en una mutación concreta entre los genes. Existen en la actualidad diversas técnicas que permiten detectar mutaciones concretas a partir de productos de PCR; dos de ellas, la PCR-RFLP y la PCR-SSCP, se han utilizado para diferenciar genes de betalactamasas de la familia de las SHV. Una mutación concreta en el gen blaSHV que genera una sustitución del aminoácido Gly238 a Ser es la causa del cambio a una betalactamasa de espectro ampliado. Se ha comprobado que dicha mutación crea un lugar de restricción para la endonucleasa de restricción Nhe I. Por ello, la amplificación mediante PCR de la región que contiene este nucleótido y la posterior digestión con Nhe I es un método sencillo para distinguir entre SHV-1 y sus derivados de espectro ampliado. Por otro lado, la técnica de PCR-SSCP se ha utilizado también para diferenciar los diversos componentes de la familia de las betalactamasas SHV de espectro ampliado.

Como hemos mencionado a lo largo de esta exposición, en la actualidad se dispone de diversas técnicas sencillas y con elevada especificidad que nos permiten diferenciar entre las betalactamasas existentes. Distinguir entre betalactamasas es importante para la realización de estudios epidemiológicos, donde la presencia de un tipo de betalactamasa poco común permite el seguimiento de una cepa particular.

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