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DISEÑO DE UN MODELO EXPERIMENTAL PARA ESTUDIAR EL EFECTO DE LOS ANTIMICROBIANOS EN POBLACIONES BACTERIANAS ORGANIZADAS
Autores:
Fernando Gomez-Aguado. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
Maria Teresa Corcuera. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
David Sevillano. Dpto. Medicina-Microbiología, F. Medicina UCM. Madrid. España
Luis Alou. Dpto. Medicina-Microbiología, F. Medicina UCM. Madrid. España
M. José Alonso. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
José Prieto*. Dpto. Medicina-Microbiología, F. Medicina UCM. Madrid. España
INTRODUCCIÓN. Los estudios in vitro de sensibilidad a los antimicrobianos (antibiograma, CMI, CMB) se utilizan como predictores de actividad. Por otro lado, es aceptada la mala actividad de los antimicrobianos en el biofilm por su baja penetración, alta concentración bacteriana en diferentes fases de crecimiento, etc. En las colonias sucede algo similar (subpoblaciones estratificadas en diferentes fases de crecimiento y alta concentración bacteriana). De este modo, la colonia podría ser un modelo de estudio para predecir la actividad de antimicrobianos en un biofilm.
MATERIAL Y MÉTODOS. Se utilizaron dos cepas de S. aureus: 1) S. aureus ATCC 29213, sensible a vancomicina (CMI = 1 mg/l) y a cloxacilina (CMI = 0,25mg/l); 2) cepa Mu3, hVISA (CMI = 2 mg/l) y resistente a cloxacilina (CMI > 1.024 mg/l). Una suspensión bacteriana de aproximadamente 108 UFC/ml fue diluida y sembrada en filtros de 0.45 µm para la obtención de colonias aisladas. Los filtros se incubaron sobre agar Mueller-Hinton a 35ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, los filtros se incubaron sobre agar Mueller-Hinton con distintas concentraciones de vancomicina (1, 2 y 16 mg/l) y cloxacilina (0.06, 0.25, 1 y 256 mg/l) a 35ºC durante 24, 48 y 72 horas adicionales. En todos los casos se procesaron controles sin antibióticos. Finalizados los tiempos de incubación, se midieron los diámetros de las colonias con un sistema de análisis de imagen y se procesaron colonias aisladas siguiendo un protocolo de inclusión en resina epoxi para el estudio de secciones transversales por microscopía óptica y electrónica previamente descrito.
RESULTADOS. No se encontraron diferencias, ni en tamaño ni en estructura, entre las colonias control y las colonias tratadas con vancomicina, independientemente de la concentración de antibiótico y del tiempo de incubación, en las dos cepas estudiadas.
Las colonias de la cepa Mu3 tampoco presentaron alteraciones al ser tratadas con cloxacilina. Lo mismo ocurrió con la cepa ATCC 29213 con concentraciones de cloxacilina iguales o inferiores a 0.25 mg/l. Sin embargo, en presencia de concentraciones iguales o superiores a 1 mg/l, las colonias detuvieron su crecimiento y experimentaron profundas alteraciones estructurales, consistentes en la encapsulación de la zona central de la colonia y un posterior recrecimiento a partir de ese núcleo central que acababa recubriendo la colonia original.
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN. La metodología descrita puede aportar información valiosa sobre el efecto de los antimicrobianos en comunidades bacterianas con elevada densidad poblacional y compleja organización, complementando los datos de sensibilidad y contribuyendo a explicar los efectos observados in vivo. Así, nuestros resultados ponen de manifiesto una clara discrepancia en la respuesta de la cepa ATCC a los antibióticos utilizados respecto de los test tradicionales de sensibilidad. En el caso de vancomicina, las colonias crecen y se desarrollan de manera normal incluso a concentraciones muy superiores a la CMI, lo que podría explicar posibles fracasos terapéuticos. En el caso de cloxacilina, se observa un fenómeno de “encapsulación” y posterior recrecimiento en presencia de una concentración 4x CMI, lo que podría relacionarse con posibles recidivas.
BIBLIOGRAFÍA. 1) Gómez-Aguado F, Gómez-Lus ML, Corcuera MT, et al. Rev Esp Quimioter 2009;22: 224-7. 2) Gómez-Aguado F, Alou L, Corcuera MT, et al. Microsc Res Tech 2010. DOI:10.1002/jemt.2097.
Palabras clave: Antimicrobianos, colonias, Staphylococcus aureus;
