40
ESTUDIO COMPARATIVO DEL CULTIVO, PCR MANUAL Y UNA NUEVA PCR A TIEMPO REAL PARA EL DIAGNÓSTICO DE TOSFERINA
Autores:
ANA Mª BLÁZQUEZ DE CASTRO. HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA. SALAMANCA. España
Mª LUZ ASENSIO CALLE. HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA. SALAMANCA. España
Mª NIEVES GUTIÉRREZ ZUFIAURRE. HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA. SALAMANCA. España
SANTIAGO MUÑOZ CRIADO. HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA. SALAMANCA. España
JESÚS IGLESIAS GARCÍA. HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA. SALAMANCA. España
JUAN LUIS MUÑOZ BELLIDO*. HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA. SALAMANCA. España
INTRODUCCIÓN. Pese a la eficacia de la vacunación, todavía se producen en el mundo 50 millones de casos anualmente, que ocasionan 350.000 muertes. La enfermedad está producida mayoritariamente por B pertussis, aunque entre un 3% y 35% se produce por B. parapertussis. La inmunidad vacunal desciente a los 7-10 años, por lo que a partir de la adolescencia se puede padecer la enfermedad y transmitirla a población susceptible (lactantes, en la mayor parte de los casos). De hecho, se considera que hasta el 20-30% de los casos de tos crónica sin factores predisponentes conocidos en adolescentes y adultos podrían ser casos de tosferina con clínica atenuada. Clásicamente, el diagnóstico se ha realizado mediante cultivo e identificación bioquímica. Sin embargo, se sabe que el cultivo tiene una baja sensibilidad (56%), debido a la labilidad de la bacteria, las frecuentes condiciones subóptimas de toma de muestras, traslado y conservación y el tratamiento antibiótico empírico previo. Recientemente se han empezado a utilizar métodos moleculares tanto para el diagnóstico directo sobre muestra como para la identificación de los cultivos. En nuestro Servicio pusimos en marcha hace tres años un método manual de PCR convencional para dicho diagnóstico. Posteriormente se ha introducido un nuevo método mediante PCR en tiempo real. El objetivo del estudio fue comparar ambos métodos, junto con el cultivo en medio selectivo para Bordetella, para el diagnóstico de la infección.
MATERIAL y METODOS. Se estudiaron 45 muestras de exudado nasal procedentes de pacientes con sospecha clínica de tosferina. Las muestras se cultivaron en medio de cultivo selectivo para Bordetella spp, con una incubación de 7 días a 37º C y en aerobiosis. La identificación de las colonias se realizó mediante especgrometría de masas MALDI-TOF (Briker Daltonics) o por P.C.R manual. Además, todas ellas se procesaron mediante PCR manual, por amplificación de un fragmento de 191 pb correspondiente al promotor de la toxina pertussis y su visualización en gel de agarosa. Posteriormente, 18 muestras elegidas de forma aleatoria fueron estudiadas mediante PCR a tiempo real (Simplexa Bordetella 2, Focus Diagnostics, USA, distribuida en España por Vitro) para detección de B pertussis y B. parapertussis.
RESULTADOS. 13 muestras (28,9%) fueron positivas por cultivo. El 100% de las mismas fueron también positivas mediante PCR manual. De las 32 muestras negativas por cultivo, 11 (34,4%) fueron positivas mediante PCR manual, que casi duplica, por tanto, la sensibilidad del cultivo. Se probaron por RT-PCR 18 muestras escogidas aleatoriamente de entre las anteriores. 13 muestras fueron positivas y 5 negativas por esta técnica. Las 5 negativas, habían sido negativas asimismo en cultivo y en PCR manual. De las 13 muestras positivas, 5 habían sido positivas por cultivo y PCR, 6 habían sido positivas sólo por PCR, y 2 habían sido negativas en ambas técnicas. Todas ellas fueron positivas para B. pertussis.
CONCLUSIONES. B. pertussis empieza a ser un microorganismo detectado de nuevo con frecuencia en nuestro medio. Los datos obtenidos demuestran que el cultivo es un método de detección poco sensible. La PCR manual incrementa el diagnóstico etiológico de estos casos en cerca del 85%. La RT-PCR probada incrementa incluso la sensibilidad de la PCR manual, al detectar un 15% de casos más, que fueron negativos en cultivo y PCR manual.
