Técnicas moleculares en el diagnóstico de las infecciones por hongos
R. Cisterna Cáncer Servicio de Microbiología Clínica, Hospital de Basurto, Bilbao.
Las infecciones fúngicas en pacientes críticos representan un verdadero problema que va incrementándose prácticamente en todos los hospitales en donde este aspecto se ha investigado, habiéndose al menos duplicado el número de infecciones en los últimos diez años. Dentro de la posible etiología, Candida spp. es el patógeno más frecuentemente identificado, especialmente en las Unidades de Cuidados Críticos, que junto con los pacientes oncohematológicos y las Unidades de Neonatología representan los tres puntos esenciales en cuanto a la presentación de este tipo de infecciones. Habitualmente, los pacientes que presentan infecciones por hongos suelen tener una enfermedad de base grave, han recibido varias tandas de antibióticos de amplio espectro y portan catéteres intravasculares. No obstante, en el paciente inmunodeprimido este perfil puede estar modificado. El diagnóstico clínico en ocasiones es difícil, por la gran cantidad de signos y síntomas inespecíficos y por la frecuencia con que estos pacientes están colonizados superficialmente por cepas de Candida, especialmente los sometidos a ventilación mecánica, lo que hace que haya que recurrir a procedimientos indirectos que nos permiten sospechar la presencia de una infección por hongos, como la persistencia de la fiebre a pesar de los antibióticos que está recibiendo, la elevación de la proteína C reactiva y la presencia de factores de riesgo. El diagnóstico microbiológico viene condicionado por los requerimientos de las especies de hongos habituales en el ser humano. La metodología convencional utiliza procedimientos de observación directa y tintoriales y el cultivo, que requiere varios días para detectar y confirmar la presencia del agente causal. Se hace necesario utilizar otro método que permita, tras la sospecha inicial, investigar rápidamente la presencia del hongo, especialmente en el caso de las micosis invasoras. Es en este punto donde posiblemente la prontitud diagnóstica pueda tener un especial significado, ya que los resultados positivos tienen una gran repercusión sobre las decisiones clínicas que pueden adoptarse, sobre el inicio de una adecuada quimioterapia antimicrobiana o el cambio hacia otro tipo de terapéutica, por lo que un diagnóstico rápido de la presencia del patógeno en un hemocultivo o en otros líquidos orgánicos habitualmente estériles se convierte en una prioridad básica de los Servicios de Microbiología. En este sentido, son bien conocidas las limitaciones que el hemocultivo convencional ofrece, ya que a pesar de que representa el estándar universal, la posibilidad de detección del hongo es reducida, del 50% en el mejor de los casos, y el tiempo necesario para permitir el crecimiento de estos patógenos es considerablemente largo, ya que al menos deben mantenerse seis días para poder determinar la posibilidad de infección fúngica. Algo parecido podría decirse de los cultivos de otros líquidos orgánicos, que requieren varios días de incubación para detectar la presencia de un patógeno fúngico. En estos momentos resulta necesario utilizar procedimientos que de una forma racional puedan ser aplicados en Microbiología Clínica para dotar de argumentos al inicio de una terapia antifúngica inmediata tras la sospecha inicial, ya que este aspecto es sin duda uno de los que más van a influir en la evolución del paciente con una micosis invasora. En los últimos años han ido surgiendo métodos alternativos a los convencionales, tales como detección de antígenos circulantes, enzimas o productos metabólicos, que según algunos no poseen sensibilidad y especificidad suficientes para obviar el inconveniente del tiempo necesario para llegar al diagnóstico específico. Desde hace algún tiempo han venido desarrollándose metodologías que tratan de detectar ácidos nucleicos de los hongos implicados en infecciones humanas, utilizando para ello técnicas que han ido evolucionando rápidamente y que en este momento permiten establecer criterios de diagnóstico de infección ciertos y rápidos, por la aplicación de métodos basados en la biología molecular, desde la detección por hibridación molecular directa sobre muestras clínicas a otros procedimientos que conllevan la amplificación de los ácidos nucleicos. En este contexto se han desarrollado distintos procedimientos para la amplificación de diversas señales que permiten ser identificadas posteriormente, pero sin duda es la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) la que más ha venido utilizándose, ya que amplificaciones de una pequeña cantidad de DNA fúngico permitirán un más rápido y sensible procedimiento para el diagnóstico de las micosis invasoras. Un elemento importante a considerar en este tipo de diagnóstico es qué muestras van a aplicarse y su preparación con el objeto de conseguir una cantidad suficiente del ácido nucleico a investigar, habiéndose diseñado distintos procedimientos para conseguir el mejor rendimiento. Con muestras de sangre hay que tener en cuenta que en ésta existen sustancias inhibidoras y que tanto los hematíes como los leucocitos deben ser lisados. La aplicación de la tecnología basada en la amplificación mediante PCR permite diseñar procedimientos que pueden detectar, a partir de una secuencia única, cualquier tipo de hongo, o bien más específicamente seleccionar las secuencias que afectan a uno determinado. De esta manera se pueden utilizar iniciadores dirigidos a secuencias únicas y específicas de hongos, dianas formadas por genes multicopia o iniciadores universales comunes a todos ellos. De cualquier forma, las posibilidades que hasta el momento se han evaluado son tanto la utilización de iniciadores universales como absolutamente específicos, dependiendo del contexto clínico y epidemiológico en que vayan a utilizarse. La utilización de un análisis por PCR que amplifica una secuencia altamente conservada del gen multicopia 18S RNAr permitirá identificar en la muestra analizada diferentes patógenos fúngicos, mientras que la utilización de distintos iniciadores, como se refleja en la Tabla 1, permitirá aproximarse a la identificación de un determinado microorganismo. Varias modificaciones a la tecnología básica de detección permiten cuantificar el patógeno aislado, o mediante restricción enzimática asegurar la diferenciación entre géneros e incluso especies. Pero las posibilidades de las técnicas moleculares basadas en la amplificación superan las de la propia detección del patógeno, ya que son extraordinariamente útiles en la diferenciación entre especies y sobre todo como herramienta válida en la epidemiología de la infección fúngica. En este aspecto, la utilización de marcadores epidemiológicos de los genotipos de los microorganismos aislados proporciona un elemento fundamental a la hora de valorar la presencia de un determinado patógeno en un paciente, sirviendo para completar la historia natural de la infección, conocer cuáles son los mecanismos de transmisión y su distribución en un hábitat determinado. Con este propósito se han utilizado distintos procedimientos moleculares, tales como la cariotipificación, el análisis de restricción y la PCR. Generalmente, técnicas como la RAPD (amplificación aleatorizada de DNA polimórfico) o el análisis de restricción enzimática (REA) se suelen utilizar aunque a veces haya que recurrir a otros procedimientos más discriminatorios, específicos y laboriosos como son la hibridación por Southern o la electroforesis en campos pulsados (PFGE).
Tabla 1. Dianas génicas para la detección de diversos hongos.
Mecanismos de resistencia antifúngica en levaduras
J. Pemán García Servicio de Microbiología, Hospital Universitario La Fe, Valencia. El fracaso de una terapia antifúngica no sólo se debe a una posible resistencia microbiana; también las condiciones clínicas del paciente tienen un papel primordial en la evolución del proceso, sobre todo en las micosis sistémicas, donde los déficit inmunitarios, la presencia de cuerpos extraños o de abscesos, el incumplimiento de la pauta terapéutica o una farmacocinética desfavorable (como puede ser el acantonamiento intracelular o la formación de biopelículas por parte de las levaduras) pueden ser determinantes en el fracaso terapéutico. A diferencia de los antibacterianos, cuyos puntos de corte están bien establecidos desde hace años, los de los antifúngicos (especialmente para fluconazol e itraconazol) se han sugerido recientemente (1), considerándose como resistente toda levadura con CMI igual o superior a 64 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l o 32 mg/l, según sea fluconazol, itraconazol, amfotericina B o 5-fluorocitosina el antifúngico ensayado. Pero no se debe olvidar que en una micosis sistémica, situación en que los factores asociados al huésped son determinantes en la evolución, la CMI no puede predecir completamente la evolución del proceso, ya que un valor bajo de ésta no equivale al éxito de la terapia; sin embargo, una CMI elevada sí es sinónimo de fracaso terapéutico. Para entender el mecanismo de resistencia a un antimicrobiano es fundamental comprender su modo de acción. Los actuales antifúngicos sistémicos, así como las equinocandinas de próxima aparición, se pueden agrupar según su mecanismo de acción en tres clases: 1) los que actúan sobre la membrana plasmática inhibiendo la síntesis del ergosterol (azoles, polienos y alilaminas); 2) los que lo hacen sobre la pared celular bloqueando la síntesis de glucano (equinocandinas); y 3) la 5-fluorocitosina, que actúa inhibiendo los ácidos nucleicos. El objetivo último de los antifúngicos que actúan sobre la membrana celular es el ergosterol, que es un regulador de la asimetría y fluidez de la membrana, y por tanto encargado de la integridad de la célula fúngica. Los azoles inhiben una enzima dependiente del citocromo P450, la lanosterol 14-alfa-desmetilasa (14 DM), provocando una disminución del ergosterol y la acumulación de esteroles metilados. Todo ello altera la estructura y función de la membrana (sobre todo el transporte de nutrientes y la síntesis de quitina), que se vuelve más permeable y vulnerable. El resultado final es una inhibición del crecimiento celular, causando un efecto fungistático. Esta propiedad fungistática de los azoles implica en muchas ocasiones tratamientos prolongados y está directamente relacionada con el desarrollo de resistencias secundarias (2). Pero, además de bloquear la 14 DM, los azoles pueden inhibir otras enzimas (como la citocromo oxidasa o la peroxidasa) o inhibir la transformación de las levaduras a su fase miceliar actuando sobre los fosfolípidos, o incluso, en el caso del miconazol y el itraconazol, dañar directamente la membrana plasmática provocando la pérdida de componentes intracelulares y por consiguiente la muerte celular. El mecanismo de acción de los polienos es doble: 1) formación de poros en la membrana plasmática a través de los cuales salen al exterior componentes intracelulares como el potasio, y 2) bloqueo de la ATPasa de la membrana y daño oxidativo directo sobre ésta. Afortunadamente, a pesar del uso generalizado de la amfotericina B durante 40 años, la resistencia secundaria a este antifúngico sigue siendo escasa, debido a que los propios cambios estructurales de la membrana para evitar la acción del antifúngico reducen la virulencia de la levadura y su tasa de crecimiento, facilitando su destrucción por los mecanismos defensivos del huésped, por lo que la relevancia clínica de esta resistencia es escasa, siendo excepcional en inmunocompetentes y muy rara en neutropénicos. No obstante, se ha observado un aumento de las candidemias por especies resistentes a la amfotericina B durante la quimioterapia en enfermos profundamente inmunodeprimidos. Las especies de Candida más proclives a desarrollar resistencia a los polienos son precisamente las menos frecuentes, C. lusitaniae, C. guilliermondii y C. glabrata, y suelen hacerlo mediante alguno de estos dos mecanismos: 1) por mutaciones de los genes pol1 a pol5, aumentando la actividad catalasa y reduciendo el daño oxidativo sobre la membrana; o 2) por defectos en los genes ERG2 y ERG3, que modifican la composición de la membrana y disminuyen la presencia de ergosterol o lo sustituyen por otros esteroles metilados (4). El último grupo de inhibidores de la síntesis del ergosterol lo constituyen las alilaminas, cuya principal representante es la terbinafina. Este grupo actúa inhibiendo uno de los primeros pasos de su síntesis, bloqueando la escualeno epoxidasa, si bien su actividad fungicida no está relacionada directamente con la depleción de ergosterol sino más bien con la acumulación de escualeno intracelular, lo que aumentaría la permeabilidad de la membrana y la síntesis de quitina, provocando la muerte celular (5). Según este mecanismo de acción, la gran sensibilidad especial que tienen los dermatófitos a esta molécula estaría plenamente justificada, ya que el contenido de quitina de estos hongos en su pared celular es muy superior al de las levaduras. Hasta el momento no se ha descrito ningún caso de resistencia clínica a la terbinafina, aunque, debido a su uso prolongado, es de esperar que aparezca (3, 6). El glucano, el manano y la quitina son componentes fundamentales de la pared celular de los hongos y se han convertido en posibles dianas de acción de nuevos antifúngicos. De entre todos los antifúngicos en estudio con actividad sobre el glucano, sólo una equinocandina, MK-0991 (Merck), está siendo sometida actualmente a ensayos clínicos en fase III, esperándose su comercialización en los próximos meses. Las equinocandinas son lipopéptidos con actividad fungicida in vitro e in vivo sobre Candida y Aspergillus. Actúan inhibiendo la beta-glucanosintetasa, lo que provoca una disminución de la síntesis de glucano e, indirectamente, de lanosterol y ergosterol. Como el compuesto aún no está comercializado, actualmente no existen cepas resistentes de origen clínico. Por tanto, el conocimiento que tenemos sobre los mecanismos de resistencia se basa en los resultados obtenidos con mutantes de laboratorio, sobre todo de Saccharomyces cerevisiae. En esta levadura, la síntesis de glucano sintetasa está regulada por los genes FKS1 y RHO1 y sus mutaciones originan resistencias in vitro de alto grado (7). Por otra parte, también se han observado resistencias de bajo grado asociadas a mutaciones del gen GNS1 (que regula la elongación de los ácidos grasos). La 5-fluorocitosina es el único inhibidor de la síntesis de ácidos nucleicos entre los antifúngicos actualmente en uso, siendo uno de los que mejor se conocen sus mecanismos de acción y de resistencia. Es una pirimidina fluorada que por sí sola no posee actividad antifúngica y necesita ser metabolizada, por los sistemas enzimáticos de la levadura, para transformarse en el compuesto activo que actuará como un antimetabolito. La 5-fluorocitosina se introduce en el interior de la levadura por la acción de una citosina permeasa y es rápidamente desaminada, convirtiéndose en 5-fluorouracilo (5-FU), que actúa por dos vías diferentes: a) transformado en 5-FUTP (5-fluoridina trifosfato) se incorporará al RNA dando lugar a moléculas aberrantes, y b) convertido en 5-dUMP (5-fluorodesoxiuridina trifosfato) bloqueará la timidilato sintetasa y, por lo tanto, la síntesis de DNA. La resistencia intrínseca o adquirida a la 5-fluorocitosina es el resultado de la ausencia o disfunción de una o más de las enzimas necesarias para su transformación intracelular. El número total de células resistentes depende de la especie: la frecuencia más baja se observa en C. albicans y la más alta en Aspergillus. La resistencia a la 5-fluorocitosina puede deberse a dos mecanismos fundamentales: El desarrollo de resistencias a los antimicrobianos es la consecuencia inevitable de su uso. El número y la variedad de las especies de levaduras resistentes a los fármacos antifúngicos se incrementará paralelamente a la utilización de éstos. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos de resistencia a estos fármacos, junto con el desarrollo de sistemas experimentales donde puedan ser aplicados, son esenciales a la hora de limitar la aparición de nuevas resistencias, así como para el desarrollo de nuevos compuestos.
BIBLIOGRAFÍA
Resistencia a los azoles de Candida albicans
S. Perea del Pino Centro de Ciencias de la Salud, San Antonio, Tejas, Estados Unidos. Candida albicans es un hongo dimórfico que puede actuar como comensal o como patógeno oportunista en el hombre. Entre los factores que predisponen al padecimiento de candidiasis figuran los tratamientos inmunosupresores y quimioterápicos, la presencia de catéteres intravenosos, bajo peso al nacer, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), diabetes y drogadicción, entre otros. Los pacientes VIH positivos desarrollan frecuentemente candidiasis orofaríngea. Candida spp. coloniza la mucosa oral del 64% al 84% de estos enfermos, causando enfermedad sistomática hasta en el 46% de ellos. El tratamiento con azoles, especialmente con fluconazol, ha demostrado ser eficaz, tanto in vitro como en estudios clínicos, frente a C. albicans, siendo considerado el tratamiento de elección en la candidiasis orofaríngea. El fluconazol inhibe la síntesis del ergosterol mediante a la unión a la enzima 14-a-esterol desmetilasa dependiente del citocromo P450, impidiendo con ello la conversión del lanosterol en ergosterol. La depleción del ergosterol celular, unida a la acumulación de ciertos compuestos intermedios en su síntesis, conlleva en última instancia una pérdida de la funcionalidad de la membrana plasmática, produciendo un efecto fungistático. En el caso de los pacientes con sida que presentan episodios recurrentes de candidiasis orofaríngea, la resistencia al fluconazol y a otros azoles se está convirtiendo en un grave problema clínico. El desarrollo de resistencia al fluconazol es un hecho complejo, en el cual intervienen diversos factores tanto del huésped como del microorganismo. Entre los factores dependientes del microorganismo figuran mecanismos celulares y moleculares. Dentro de los primeros destacan: Entre los mecanismos moleculares de resistencia a los antifúngicos hasta ahora descritos en C. albicans figuran los siguientes: A pesar del conocimiento de los distintos mecanismos moleculares por los cuales C. albicans es resistente al fluconazol, no se ha establecido todavía la prevalencia de dichos mecanismos en clínica. En la Universidad de Texas en San Antonio se está llevando a cabo un estudio longitudinal y prospectivo cuyo objetivo es caracterizar la prevalencia de los mecanismos de resistencia a los azoles en un total de 64 pacientes VIH+ con candidiasis orofaríngea. Al inicio del estudio los pacientes presentaban una cifra de CD4 <50/mm3, siendo la duración media de permanencia en el estudio de 18 meses (1 a 54). Se tomaron muestras (lavado bucal y torunda) en cada visita durante el episodio de candidiasis orofaríngea y cada tres meses (cultivos de seguimiento). Los aislamientos se identificaron por caracteres fenotípicos (color de la colonia en CHROMagar, API 20C AUX, formación de tubo germinativo) y genotípicos (técnicas de tipificación de DNA [cariotipificación, RFLP, hibridación con sonda de DNA Ca3 específica para C. albicans]). Se determinó la sensibilidad a los azoles (fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol [SCH 565921]) y a amfotericina B siguiendo las normas del NCCLS. Se estudiaron los siguientes mecanismos de resistencia: sobreexpresión de sistemas de transporte activo (MDR1, CDR, CDR1, CDR2), sobreexpresión de la enzima diana (14-a-esterol desmetilasa [ERG11]) y mutaciones concretas en ERG11. Un 22% (14/64) de los pacientes evaluados presentaron aislamientos de C. albicans resistentes al fluconazol (CMI ³64 mg/l). En el 86% (12/14) de estos pacientes el desarrollo de resistencia al fluconazol tuvo lugar en una cepa persistente. El 93% (13/14) de estos pacientes inicialmente respondieron al tratamiento con fluconazol, fracasando el 31% (4/13) después de 112 a 1069 días de tratamiento con dosis de hasta 800 mg/día. Molecularmente el desarrollo de resistencia al fluconazol se caracterizó por una combinación de mecanismos de resistencia. Algunos aislamientos presentaban resistencia cruzada a otros azoles, aunque no se pudo establecer una estricta correlación entre mecanismo de resistencia y aumento de la CMI. El carácter multifactorial de la resistencia de C. albicans a los fármacos antifúngicos azólicos existentes hace necesaria la adopción de nuevas estrategias para combatirla, como son el desarrollo de moléculas más potentes (voriconazol, posaconazol), combinaciones de antifúngicos azólicos con compuestos que inhiban su expulsión de la célula fúngica (inhibidores de los transportadores activos de membrana), investigación de nuevos antifúngicos con nuevas dianas y mecanismos de acción (pradimicinas, equinocandinas) y, por último, combinaciones de antifúngicos con fármacos inmunomoduladores que refuercen el sistema inmunitario. BIBLIOGRAFÍA
Mecanismos de resistencia de hongos filamentosos
J.L. Rodríguez Tudela Servicio de Micología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid. La detección de la resistencia a los antifúngicos de los hongos filamentosos está en su infancia. Numerosas variables quedan por analizar y entre ellas destacan la composición y el tamaño del inóculo, la temperatura y el tiempo de incubación, especialmente para los de crecimiento lento, y la forma de establecer la CMI. A pesar de estas incertidumbres, el NCCLS ha publicado una proposición de estándar conocida como documento M38P. Otros laboratorios, principalmente en Europa, han desarrollado otros métodos alternativos que ofrecen resultados comparables. En esta situación, y antes de abordar el estudio de los mecanismos de resistencia que han desarrollado los patógenos para evitar su destrucción, hay que revisar qué capacidad tiene el laboratorio para detectar dicha resistencia. En relación con la amfotericina B, se asume que ciertos hongos filamentosos, como por ejemplo Scedosporium apiospermum y Scedosporium prolificans, son intrínsecamente resistentes. Por el contrario, Aspergillus fumigatus, el más prevalente, se considera sensible. Sin embargo, un porcentaje elevado de estas infecciones no responde a un tratamiento convencional. A pesar de que la población diana reune unas características muy especiales, no todos los fracasos terapéuticos se deben atribuir a las condiciones del huésped, sino que otras variables, como por ejemplo el desarrollo de resistencia, deben incluirse en el análisis. Desde el punto de vista del laboratorio, la situación con la amfotericina B es más que confusa. La distribución de las CMI de A. fumigatus y Aspergillus flavus frente a este antifúngico es unimodal. Por tanto, microbiológicamente no se pueden distinguir las supuestas cepas resistentes. Por el contrario, con Aspergillus terreus se evidencia la aparición de otra población con CMI más elevadas. El análisis de un modelo experimental murino de infección por A. fumigatus añade aún más controversia. En dicho modelo se emplearon dos cepas de A. fumigatus aisladas de dos pacientes. Uno de ellos había respondido al tratamiento con amfotericina B y el otro no. La cepa sensible al tratamiento tenía una CMI de 2 mg/l y la resistente de 1 mg/l. Los ratones fueron tratados con diversas dosis de amfotericina B y se comprobó que la cepa proviniente del paciente que no había respondido al tratamiento disminuía su supervivencia en comparación con la de aquellos ratones infectados con la cepa aislada del paciente curado. Por el contrario, otros autores encuentran una buena correlación entre las CMI y la evolución clínica de la aspergilosis invasora y, así, aquellos aislamientos que tenían una CMI ³2 mgll se correlacionaban con fracaso terapéutico y los que tenían una CMI <2 mg/l con buena evolución. Sin embargo, es de sobra conocido que la reproducibilidad del método no puede asumir un punto de corte tan estricto. Por otro lado, dos artículos publicados con una diferencia de cuatro años llegaban a las mismas conclusiones y por ello merece la pena comentarlos de forma conjunta. En ellos se determinaron, mediante HPLC y bioensayo, las concentraciones de amfotericina B en los tejidos de pacientes que habían fallecido por infección fúngica diseminada a pesar de estar recibiendo tratamiento con amfotericina B. La conclusión más relevante de ambos estudios es que existen factores sin determinar que limitan la actividad in vivo de la amfotericina B. Tras estas consideraciones, se puede concluir que no estamos en condiciones de identificar la resistencia a la amfotericina B en el laboratorio. Desde un punto de vista práctico y sin demasiadas evidencias, se puede asumir que aquellas cepas o especies con CMI por encima de 4 mg/l se deben considerar como resistentes al tratamiento con dosis convencionales de amfotericina B. En relación con los azoles la situación es diferente. El análisis de la distribución de las CMI del itraconazol frente a A. fumigatus indica la aparición de una población con CMI elevadas que puede corresponder a aislamientos resistentes. Además, las pruebas in vitro son reproducibles y separan de forma adecuada las supuestas cepas resistentes de las sensibles. Cuando estos aislamientos se utilizan en modelos murinos de infección diseminada se comprueba que los ratones infectados con las cepas resistentes tienen una menor supervivencia que los infectados con las cepas sensibles. Por tanto, el laboratorio es capaz de identificar los aislamientos resistentes al itraconazol. Se están dando los primeros pasos para identificar los mecanismos de resistencia de estas cepas de A. fumigatus, pero los resultados son preliminares. Se han propuesto las siguientes posibilidades para explicar la resistencia al itraconazol: – Aumento de la expulsión del fármaco. – Aumento de la expresión del gen ERG11. – Mutación del gen ERG11. Se han identificado genes que codifican proteínas de la familia ABC (ATP-binding cassette) en los siguientes hongos filamentosos: – Aspergillus fumigatus AfuMDR1, AfuMDR2 – Aspergillus flavus AflMDR1 – Aspergillus nidulans AtrA, AtrB – Penicillium digitatum PMR1 – Botrytis cinerea BMR1 Además, la ausencia de esteroles intermediarios en una de las cepas de A. fumigatus resistentes al itraconazol sugiere una alteración de la 14-a-desmetilasa. En resumen, aunque se han empezado a detectar hongos filamentosos resistentes al itraconazol, los mecanismos por los cuales éstos adquieren la resistencia están por dilucidar. Probablemente sean similares a los de otros patógenos como Candida albicans, aunque habrá que demostrarlo. La existencia en los hongos filamentosos de genes que codifican proteínas de la familia ABC indica que la expulsión de los azoles del interior celular puede ser uno de los principales mecanismos de resistencia, aunque no hay que olvidar que en otras especies de hongos patógenos humanos la suma de varias alteraciones da lugar al fenotipo de resistencia. BIBLIOGRAFÍA
Métodos de estudio de la sensibilidad in vitro de levaduras
E. Martín Mazuelos Servicio de Microbiología, Hospital Universitario de Valme, Sevilla. Las infecciones fúngicas han adquirido una gran importancia en las últimas décadas, debido no sólo a su mayor frecuencia de aparición (aumento de pacientes con estado de inmunodepresión avanzada) sino también a su alta morbilidad y mortalidad (1). Paralelamente se ha observado un incremento en la aparición de nuevas especies patógenas, tanto de levaduras como de hongos filamentosos (2-5). Todas estas circunstancias han conducido a los clínicos a usar con más frecuencia los antifúngicos y a hacerlo a dosis altas, originando en muchos casos la aparición de resistencias, especialmente a los derivados azólicos, relacionadas con el uso de estos fármacos, y como consecuencia de todos estos problemas ha surgido la necesidad de investigar nuevos antifúngicos (5). Por todas las razones anteriormente expuestas, los estudios de sensibilidad in vitro a los antifúngicos se hacen cada vez más necesarios, al igual que ocurría con los antibacterianos y las bacterias, para poder conocer la actividad in vitro de los antifúngicos clásicos y nuevos, y así poder predecir el éxito o el fracaso de la terapia. Estos estudios también permiten realizar una investigación epidemiológica. A diferencia de lo que ocurre con los antibacterianos y con 30 años de retraso respecto a ellos, los primeros estudios de sensibilidad antifúngica, que datan de los años 1950, a pesar de carecer de reproducibilidad y de correlación in vivo no planteaban problemas puesto que, aunque ya se conocía la existencia de resistencia intrínseca de algunos hongos (Candida lusitaniae, Pseudallescheria boydii, Fusarium spp., Trichosporon beigelii) a la amfotericina B, al ser éste el único antifúngico existente no había alternativa de tratamiento (1, 6). En 1981 un grupo de micólogos europeos pertenecientes a la Sociedad Francesa de Micología Médica intentaron introducir, para los hongos y los antifúngicos, técnicas similares a las que se usaban para las bacterias, pero los resultados fueron malos (7). En 1982, el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) se sensibiliza respecto a este tema y crea un subcomité para estudiar la sensibilidad a los antifúngicos (8-10). Para ello, lo primero que hicieron fue enviar una encuesta a 500 hospitales americanos para ver en qué situación se encontraban en cuanto a resistencia a los antifúngicos, y encargan trabajos multicéntricos de tres años de duración, pero la evaluación de los resultados en cuanto a reproducibilidad y correlacion in vivo fue mala, debido a los múltiples factores que influían en la determinación de la sensibilidad de los hongos (características del hongo, tamaño del inóculo, medio de cultivo, pH, temperatura y tiempo de incubación, determinación del punto final, tipo de antifúngico, etc.) (1, 11, 12), que eran similares a los de las bacterias pero mucho mas complejos. Tras unos años de silencio, en los que estos mismos investigadores siguen trabajando en colaboración con otros (13-17), el subcomité del NCCLS publica una propuesta de estandarización como resultado de estos trabajos, el documento M27P de 1992 (18), en el que se establece un método de macrodilución en caldo, usando un inóculo de 0,5-2,5 ´ 103 UFC/ml, un medio líquido RPMI 1640 tamponado con MOPS a pH 7, incubación de 48 horas (Candida spp.) o 72 horas (Cryptococcus neoformans var. neoformans) a 35 ºC y un criterio de lectura del punto final distinto según el antifúngico (inhibición del crecimiento en un 80% para todos los azoles y 5-fluorocitosina e inhibición total para amfotericina) por espectrofotometría. Este documento no pudo ser definitivo por presentar una serie de problemas: 1) Método complejo para el trabajo habitual de un laboratorio (macrodilución). 2) No establecía puntos de corte. 3) Sólo aplicable a C. albicans y C. neoformans, no incluía Candida krusei. 4) No detectaba la resistencia a la amfotericina B. 5) Poca correlación con lo que acontecía in vivo. 6) No incluía cepas controles. Por todo ello se procedió a hacer una revisión exhaustiva del documento y, como resultado, el subcomité del NCCLS publicó otro documento tentativo en 1995, el M27T (19), que incluía: – Un formato de microdilución además de la macrodilución. – Cambio de inóculo (104 UFC/ml) y de medio de cultivo (Yeast Nitrogen Base, YNB) para C. neoformans, que presentaba un crecimiento muy pobre en el RPMI 1640 (20). – Cepas controles (21). – Medio antibiótico no 3 (AM3) para detectar las resistencias a amfotericina B en Candida spp. y C. neoformans, ya que este medio separaba mejor los valores de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de las cepas sensibles y resistentes (22, 23). Aunque este documento representaba una aproximación a la estandarización, ésta no se consigue hasta junio de 1997, fecha en que se publica el documento aprobado M27A (24), que ya se acepta como el método estándar para el estudio de la sensibilidad antifúngica in vitro de levaduras. Las principales modificaciones que se introducen son los puntos de corte para fluconazol e itraconazol, basados en datos de correlación clínica en infecciones orofaríngeas por Candida en pacientes con sida (25), y para 5-fluorocitosina.
A pesar de considerarse estándar, este método seguía teniendo una serie de problemas:
1) La introducción del medio AM3 no discriminaba bien las cepas sensibles y resistentes a la amfotericina B y los resultados cambiaban con la marca y el lote del medio usado, sobre todo con los lotes (26), pero a pesar de estas diferencias las cepas resistentes en todos los lotes tuvieron CMI ³0,5 mg/l y las sensibles <0,125 mg/l, pero interesaba discriminar mejor estas CMI.
2) El método de microdilución, aunque más fácil de realizar que la macrodilución, seguía siendo engorroso para ser introducido como procedimiento habitual en un laboratorio clínico.CMI.
3) La correlación con los resultados in vivo no era del todo satisfactoria, debido a las múltiples variables que influían en el método y a las características del huésped (8).CMI.
Para solucionar todos estos problemas se han buscado métodos alternativos al documento M27A del NCCLS:CMI.
MéTODOS CUALITATIVOS Difusión en agar La utilidad de los métodos de difusión en agar para estudiar los antifúngicos ha sido limitada por los problemas de difusión de la mayoría de los agentes antifúngicos y por la falta de correlación de los halos de inhibición con la clínica. Sólo se ha encontrado correlación en los fármacos más solubles en agua (fluconazol y 5-fluorocitosina) (5). Son varios los autores que establecen una buena correlación entre los halos de inhibición de los discos de fluconazol (25 µg, 50 µg) en distintos medios de cultivo (HR, YNB y RPMI 1640 con o sin glucosa) (27-30) y los valores de CMI obtenidos por el método de referencia (NCCLS). En algunos casos estos métodos no diferencian bien entre cepas dependientes de la dosis y resistentes, siendo necesario recurrir a métodos cuantitativos (28).
MéTODOS CUANTITATIVOS E-test® Método cuantitativo de difusión en agar comercializado (AB biodisk), basado en gradientes de concentración de un antimicrobiano impregnado en una tira de plástico inerte colocada sobre una placa de agar. La correlación con el método del NCCLS es variable según los estudios (40% a 100%) (8, 31-34) y depende de:
– El medio de cultivo, siendo mejor la casitona y el RPMI 1640 con un 2% de glucosa que el medio RPMI 1640 sin glucosa (35). – La asociación de especie y antifúngico, siendo peor para C. glabrata con fluconazol (8, 34), C. tropicalis con fluconazol (8), C. parapsilosis con itraconazol (33) y C. neoformans con amfotericina B (8, 30, 33, 34). – El tiempo de incubación, que es mejor a las 24 horas que a las 48 horas (5) para Candida spp. y de 48 horas para C. neoformans. . – El antifúngico, resultando peor para los azoles porque la lectura es más problemática por la aparición de doble halo. En nuestro trabajo (34) observamos una correlación global para el fluconazol del 74,6% y para el itraconazol del 61,7%. Las especies que presentaron más problemas de lectura fueron C. albicans (34) y C. tropicalis (31). En el caso de C. neoformans observamos una buena correlación con fluconazol y 5-fluorocitosina (81% y 90%); sin embargo, con itraconazol la correlación fue inferior al 60%.. Para la detección de resistencia a la amfotericina B parece ser el método de elección por permitir una mayor discriminación entre las cepas sensibles y resistentes, usando indistintamente el medio RPMI 1640 o el AM3, ambos suplementados con un 2% de glucosa, tanto para Candida spp. como para C. neoformans, sólo cambiando los tiempos de incubación de 24 horas para Candida spp. y 48 a 72 horas para Cryptococcus spp. (35-37). Nuestros resultados y los de otros autores (31-37) sugieren que este método podría ser útil como norma para Candida spp. y Cryptococcus spp. con amfotericina B y 5-fluorocitosina, y poco útil para los azoles. Método colorimétrico Es un método basado en la microdilución del NCCLS con un indicador de crecimiento de oxidorreducción (azul Alamar), comercializado (Yeast One Sensititre, Izasa), que tiene la ventaja de que la lectura de los puntos finales es más objetiva al manifiestarse por un cambio de color de azul a rojo o púrpura, pero los azoles siguen siendo los más problemáticos de leer. La correlación es también variable según los estudios (43% a 100%) (5, 8, 38, 39), siendo menor para C. krusei con 5-fluorocitosina (39) y C. glabrata y C. tropicalis con fluconazol (8, 39), y mayor para C. krusei y C. tropicalis con amfotericina B y C. krusei con itraconazol (39). C. neoformans muestra mejor correlación con fluconazol y amfotericina B que con itraconazol y 5-fluorocitosina (5, 39). La lectura a las 24 horas ofrece mejor correlación con la clínica (5), excepto con amfotericina B, que se aconseja leer a las 48 horas. Este método no parece útil para la detección de cepas resistentes a la amfotericina B (40). OTROS MéTODOS Dilución en agar Se basa en el uso de placas de Yeast morphology agar (YMA) con distintas concentraciones de fluconazol (0,125-256 mg/l), inoculadas con una suspensión de levaduras (Candida spp. y C. neoformans), incubadas a 35 ºC y leídas a las 24 horas (Candida spp.) o a las 72 horas (C. neoformans), de tal forma que se determina la CMI en la concentración de la placa donde se observa una disminución considerable del tamaño de la colonia (41). Se ha observado una buena correlación con el método de referencia (NCCLS), de tal forma que se podría utilizar como método alternativo, por ser barato, para el screening de resistencia al fluconazol, si bien se podría abreviar el protocolo limitando el número de placas a tres (1, 8 y 32 mg/l). Medio CHROMagar Utilizado para Candida con distintas concentraciones de fluconazol (8 y 16 mg/l), se observa que el 93% de las cepas que crecen en el medio con 8 mg/l tienen una CMI ³8 mg/1 y el 94% de las que crecen con la concentración de 16 mg/1 tienen una CMI >16 mg/l (42). Se han intentado introducir métodos más complejos pero con mayor posibilidad de automatización, como la citometría de flujo, para estudiar la sensibilidad de C. albicans a la amfotericina, el fluconazol, el ketoconazol, la 5-fluorocitosina y el itraconazol, y ha resultado ser un método rápido y sensible (43), así como un método fotométrico basado en la cuantificación de células fúngicas (Candida spp. y C. neoformans) por la reducción del MTT (3-4,5-dimetil-2-tiazol-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro) a las 24 horas, obteniendo una correlación de más del 94% con el método de referencia del NCCLS (44). Aunque se ha avanzado mucho en los métodos de estudio de la sensibilidad in vitro de las levaduras, y a pesar de existir métodos que se consideran estándar, quedan aún muchos puntos por aclarar y los estudios a este respecto continúan para encontrar mejoras que aproximen al máximo los datos in vitro a los resultados in vivo. Estos estudios se basan fundamentalmente en el inóculo, los tiempos de incubación, las formas de lectura del punto final, las modificaciones del medio de cultivo, etc., y se sabe que el subcomité del NCCLS está pendiente de reunirse en fechas próximas para concretar algunos puntos, por lo que se espera una próxima modificación del documento M27A (45). BIBLIOGRAFÍA
Métodos para determinar la sensibilidada los antifúngicos de los hongos filamentosos
J. Guarro Artigas Unidad de Biología y Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Rovira i Virgili, Reus, Tarragona. El espectro de especies fúngicas que causan infecciones en el hombre ha aumentado notablemente en los últimos años. Hasta hace poco las únicas especies que tenían un cierto significado clíacute;nico en nuestro medio eran Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus y los dermatófitos. Actualmente esta situación está cambiando con la constante aparición de nuevos hongos oportunistas, que afectan especialmente a los pacientes inmunodeprimidos. El diagnóstico y tratamiento de tales infecciones representa un considerable reto para la moderna medicina. La detección de estas infecciones suele ser muchas veces complicada y con frecuencia tardía. Muchas cepas causantes de tales procesos no se identifican en cuanto a especie, dificultando trabajos posteriores de revisión y especialmente estudios de correlación in vitro-in vivo sobre la eficacia de los antifúngicos disponibles. Para el correcto tratamiento de estas infecciones es conveniente poder disponer de métodos de referencia para la determinación in vitro de la sensibilidad antifúngica de los aislamientos clínicos, que permitan orientar la terapia. En el caso de los hongos unicelulares se ha avanzado bastante en este sentido y se han publicado ya varias técnicas con excelente reproducibilidad, cuyos resultados muestran una correlación con los resultados clínicos aceptable y parecida a la de los antibacterianos (1). En el caso de los hongos miceliares el progreso ha sido mucho más lento. Sin embargo, podemos considerar el método propuesto por el NCCLS (2), como resultado de varios estudios multicéntricos llevados a cabo en Estados Unidos, como un punto de partida para futuros trabajos con una base más sólida. Dicho método representa una referencia obligada, pero presenta ciertas limitaciones tales como el espectro reducido de hongos al que es aplicable. Considerando el elevado número de especies oportunistas y la gran diversidad morfológica que presentan los hongos filamentosos, es necesario un mayor esfuerzo para el desarrollo de nuevas técnicas de aplicación universal. Uno de los aspectos técnicos más controvertidos es el tipo y el tamaño del inóculo. La preparación del inóculo para el desarrollo de la técnica de sensibilidad antifúngica en hongos filamentosos presenta una serie de dificultades inherentes a su propia morfología, que no se dan en el caso de las levaduras ni de las bacterias (3). El manejo, recuento, dilución y transferencia de hifas muestra un mayor grado de dificultad que el de los conidios, por lo que las técnicas de sensibilidad antifúngica suelen realizarse con estos últimos a pesar de que la forma invasora de los hongos filamentosos la constituyen las hifas. Estudios con Aspergillus demuestran, sin embargo, que la sensibilidad antifúngica mostrada por conidios e hifas, que en este caso presentan paredes de grosor parecido, no es significativamente diferente. Este aspecto no ha sido investigado en otras especies con conidios de paredes de mayor grosor que las de las hifas. Salvo algunas excepciones (4), los estudios que han intentado correlacionar los resultados obtenidos in vitro con los tratamientos experimentales son desalentadores, siendo una de las causas el no disponer de modelos animales adecuados y fiables (5). Además, la casuística de este tipo de infecciones no es lo suficientemente alta como para poder sacar datos concluyentes acerca de los antifúngicos más útiles y las dosis más adecuadas. Por desgracia, muchos de los casos clínicos publicados no están lo suficientemente documentados y la información que aportan es muy poco útil. Según nuestro punto de vista, la determinación de la sensibilidad antifúngica de los hongos filamentosos no debería realizarse de forma habitual y a ser posible debería llevarse a cabo en laboratorios de referencia. El diseño de técnicas más simples y preferentemente en medio sólido, junto con el desarrollo de nuevos modelos experimentales, facilitaría la realización de estudios de correlación in vitro-in vivo, indispensables para la predicción de la respuesta clínica del complejo proceso biológico que la infección fúngica representa. BIBLIOGRAFíA
Patógenos fúngicos emergentes
P. Muñoz Servicio de Microbiología, Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid. Las infecciones micóticas, tanto profundas como superficiales, han experimentado en los últimos años un sustancial aumento en su incidencia y en la diversidad de las especies implicadas. Esto se debe en parte al cada vez mayor número de pacientes inmunodeprimidos y de pacientes que precisan largas hospitalizaciones, que conllevan el uso de dispositivos intravasculares y de antimicrobianos de amplio espectro. Candida es el patógeno fúngico emergente más importante. La candidemia ha aumentado su frecuencia diez veces y ya supone aproximadamente un 8% de los hemocultivos positivos en los hospitales. En muchos centros Candida es el cuarto microorganismo más frecuentemente aislado de hemocultivos. Por otra parte, la aparición cada vez más frecuente de cepas distintas de Candida albicans, que suponen ya más del 50% de los aislamientos en muchos centros, y de cepas resistentes a los azoles, convierte a este microorganismo en una fuente de intensa preocupación. Finalmente, se han descrito especies nuevas, como Candida dubliniensis. Las infecciones causadas por Cryptococcus neoformans experimentaron también un importante incremento de incidencia en relación con la epidemia de sida, aunque su frecuencia ha descendido tras la extensión del uso de tratamientos antirretrovirales de alta eficacia. La aspergilosis y la mucormicosis son así mismo cada vez más frecuentes en nuestros hospitales. Se han descrito nuevas formas clínicas, como la aspergilosis traqueobronquial del paciente sometido a trasplante pulmonar, y cada vez son más comunes las formas cutáneas de mucormicosis. Los hongos dimórficos han afectado de forma muy especial a los pacientes con sida que residen o han viajado a zonas geográficas endémicas. En nuestro país estamos asistiendo a un importante incremento de las infecciones causadas por hongos altamente resistentes a los antifúngicos que producen infecciones diseminadas y de alta mortalidad, fundamentalmente en pacientes neutropénicos.
Candida dubliniensis
C. Rubio-Calvo1,2, J. Pontón3, A. Rezusta2,4, J. Gil1,2 y R. Benito1,2 1Servicio de Microbiología, Hospital Clínico Universitario de Zaragoza; 2Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de Zaragoza; 3Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad del País Vasco; 4Laboratorio de Microbiología, Hospital San Jorge, Huesca. INTRODUCCIÓN Los aislamientos de Candida albicans "atípicas", es decir, parecido fenotipo pero distinto genotipo, habían sido comunicados por diferentes autores en estos últimos años (1-5). Pueden definirse como levaduras de crecimiento en Sabouraud, con o sin cicloheximida, a las 48 horas a 37 °C, produciendo colonias cremosas, no pigmentadas, que filamentan. Producen blastoconidias con pseudohifas, hifas verdaderas y abundantes clamidoconidias, como C. albicans, pero no coinciden con los esquemas de identificación (asimilación/fermentación) existentes en las bases de datos de los últimos años. Estos hechos, junto al deseo de subclasificar genotípicamente la especie C. albicans, han llevado a la realización de una serie de trabajos (6-8) en que se apunta la diversidad genotípica de esta especie. Sullivan y cols. (3) realizaron en 1993 una tentativa de clasificación de las especies de Candida aisladas de candidosis orales de pacientes VIH+ mediante tipificación genómica, fingerprinting molecular con oligonucleótidos compuestos de secuencias repetitivas simples que permiten hibridar con el DNA total fragmentado con Eco R1. Comprobaron que las cepas "atípicas" hibridan sólo parcialmente con la sonda específica para C. albicans 27A de Scherer y Stevens (9), y también, mediante PCR arbitraria, que la cepa de la colección NCPF 3108, considerada entonces Candida stellatoidea, también era "atípica". En 1995 se publican tres trabajos clave. En los de McCulloug (4) y Boerlin (5) se apuntan claramente las diferencias entre C. albicans "típica" y las denominadas "atípicas", y en una tercera publicación, la de los irlandeses Sullivan y Coleman (10), se avanza lo suficiente como para definir una nueva especie que, por razones obvias, es denominada Candida dubliniensis. En esa publicación se establecen los requisitos fenotípicos y genotípicos necesarios para que sea admitida como tal, demostrando que algunas de las anteriormente consideradas C. albicans "atípicas" pertenecían a la nueva especie que proponen. Los estudios genotípicos de C. dubliniensis incluyen también la falta de hibridación con las sondas Ca3 de Soll (5) y CARE-2 (11), análisis del cariotipo (10-14), análisis de fragmentos de restricción (10, 15, 16) y secuenciación de los genes RNAr 28S (10, 12, 14). Todos estos trabajos han apoyado que C. dubliniensis es un nuevo taxón separado de C. albicans. En la Tabla 1 figura la relación entre los antiguos genotipos A, B, C y D de C. albicans descritos por Sherer en 1987 (14) y la sensibilidad o resistencia a la flucitosina establecida por McCullough (15), y se concluye que el genotipo denominado D es C. dubliniensis, muy sensible al fluconazol, y el B corresponde a la desaparecida Candida stellatoidea I; C. stellatoidea II se considera C. albicans sacarosa negativa (17). Actualmente se han desarrollado sondas específicas Cd2 para C. dubliniensis (18) y PCR usando cebadores derivados del gen regulador del pH (genes PHR1 y PHR2) para diferenciar C. dubliniensis de C. albicans (19). Tabla1. Genotipos de C. albicans, relación con C. dubliniensis y resistencia antifúngica - Genotipo A (banda de 3,7 kb)* resistencia a flucitosina** - Genotipo B (banda de 4,2 Kb por un inserto de 379 pb en el gen de 25S RNAr (DNAr)* S a 5FC= C. stallatoidea I - Genotipo C comn ambas sensibilidad I a 5FC** - Genotipo D. sin bandas = Candida dubliniensis, muy sensible a fluconazol** * Scherer y Stevens(6). ** Mc Cullough y cols(15). Tabla 2. Frecuencia de aislamientos de C. dubiniensis según país(20). Tabla3. Incidencias de C. dubliniensis(14). Tabla 4. Frecuencia de aislamientos de C. dubliniensist según la localización anatómica(20). Tabla 5. Esquema de identificación fenotípica de C. dubliniensis - Colonias verde oscuro CHROMagar candida - Mayor filamentación y clamidosporas abundantes - NO crecimiento a 45 oC en SIDA - Negativa la ß-galactosidasa - Lectura "atípica" de asimilación de carbohidratos en sistemas comerciales miniaturizados , si son antiriores a 1998-1999 - Actualmente se están desarrollando Api20 AUX, ID 32C, RapID Yeast Plus, Vitek 2 ID, YST - Inmunofluorescencia positiva con antisuero específico INCIDENCIA Una vez establecida y aceptada la existencia de una nueva especie tan parecida fenotípicamente a C. albicans cabría preguntarse cuántos errores diagnósticos se habrán realizado identificando como C. albicans las que eran C. dubliniensis. Posiblemente, el porcentaje de C. dubliniensis en los archivos de C. albicans tal vez sea de aproximadamente un 2% (14). C. dubliniensis se ha aislado en diversos países (20), como figura en la Tabla 2. En España (21, 22) se ha asociado a pacientes adictos a drogas por vía parenteral.. Se aísla más frecuentemente de candidosis orales y pacientes VIH+ (Tabla 3), pero su frecuencia, según una investigación de diversos pacientes y diferentes productos patológicos (20), revela que en el intestino de los pacientes hematológicos es donde mayor proporción adquiere, aunque la cantidad sea mayor en la cavidad oral por el mayor número de casos estudiados (Tabla 4). CARACTERES FENOTíPICOS ¿Cómo puede identificarse C. dubliniensis en un laboratorio de microbiología clínica? Un esquema sencillo y práctico figura en la Tabla 5. Las colonias son prácticamente iguales a las de C. albicans; tal vez sea más frecuente el dimorfismo en colonias grandes y pequeñas. Es resistente a la cicloheximida, por lo que puede crecer en Mycosel o Mycobiotic. La filamentación es fuertemente positiva y las clamidoconidias mucho más abundantes en C. dubliniensis que en C. albicans, primera diferencia destacada por Sullivan (10) y señalada en 1983 por Akisada (23). Kirkpatrick (16) ha establecido los porcentajes entre ambas especies (Tabla 6). Antigénicamente, C. dubliniensis corresponde al serotipo A de C. albicans (10). Crece con dificultad a 42 ºC y no lo hace a 45 ºC, mientras que C. albicans crece a ambas temperaturas (24). Algunos autores consideran que esta prueba es difícil de valorar, a no ser que se tenga un control exacto de las estufas (15). En CHROMagar-Candida produce unas colonias verde oscuro que la diferencian del azul verdoso de C. albicans (15, 25). Este carácter puede perderse en los subcultivos, por lo que es más útil emplearlo en cribados de aislamientos primarios. En medio de Sabouraud con azul de metileno C. dubliniensis produce colonias no fluorescentes con luz ultravioleta, mientras que las de C. albicans emiten fluorescencia amarilla (25). La b-glucosidasa intracelular es negativa (5) y coaglutina con Fusobacterium nucleatum (26). Bikandi (27) ha desarrollado un antisuero específico para su tipificación. En cuanto a la asimilación de carbohidratos, las diferencias entre entre C. dubliniensis y C. albicans se muestran en la Tabla 7. La trehalosa es asimilada por C. dubliniensis en el 50% de los aislamientos de Sullivan y un 20% de ellas son palatinosa negativo (C. albicans es siempre positivo). El glicerol es positivo en un 88%, frente al 14% en C. albicans. En el resto de los carbohidratos las pruebas pueden ser compartidas por ambas especies. Actualmente se han desarrollado pruebas comerciales miniaturizadas y automatizadas, como API 20C AUX, API 32D, VITEK-2 y el sistema RapID Yeast Plus, que prometen ser eficaces una vez hayan puesto sus bases de datos en sintonía con las características de la mayoría de los aislamientos (28). Pasado un tiempo, la identificación habitual de C. dubliniensis en los laboratorios de microbiología clínica será mucho más fácil que en el momento actual. Tabla 6. Identificación de C. dubliensis por la formación de clamidoconidias(16). Tabla 7. Perfil diferencial de asimilación de carbohidratos de C. dibliniensis y C. albicans Tabla 8. Sensibilidad de 30 C. dubliniensis a nuevas moléculas de antifúngicos, azoles y 5-fluorocitosina(32). Sensible 100% a:
Fluconazol 86,6% (26/30) Itraconazol 93,3% (28/30) POSIBLES DETERMINANTES DE PATOGENICIDAD C. dubliniensis posee una intensa capacidad de producir hifas y unirse a las células epiteliales de la boca. Además, genera una elevada cantidad de aspartil proteasa (29). Ambas propiedades pueden considerarse factores de virulencia en una especie cuya clínica más destacada es la candidosis oral. En pruebas experimentales de inoculación al ratón estas cepas no presentan una gran capacidad invasora; tal vez no dispongan de eficaces sideróforos, lo que explicaría el hecho de su raro aislamiento en hemocultivos. Sin embargo, poseen estructuras para adherirse eficazmente a las células epiteliales. Este tipo de virulencia selectiva es semejante al observado por nosotros (30) en cepas de C. albicans aisladas de perionixis, que son intensamente lipasa positivas, a diferencia de las aisladas en hemocultivos. Tabla9. Sensibilidad de 71 C. dubliniensis a varios antigúngicos(31)
SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS En los aislamientos primarios C. dubliniensis es muy sensible a los azoles (incluido fluconazol, con CMI 0,5 mg/l), así como a los polienos (31, 32). En las Tablas 8 y 9 figuran datos de sensibilidad y resistencia de C. dubliniensis a distintos antifúngicos. En pacientes con candidosis oral recurrente pueden encontrarse cepas con sensibilidad disminuida al fluconazol (15, 33), lo que se explicaría por poseer una gran capacidad para desarrollar resistencia estable in vitro (33). El mecanismo de resistencia al fluconazol en C. dubliniensis se debe al sistema de flujo llevado a cabo por las proteínas de membrana del sistema MDR1 del sistema MF (Major Facilitators), que usan como fuente de energía el gradiente de protones de membrana (34), y no como ocurre con otros azoles lipofílicos en C. albicans, que usan las proteínas codificadas por los genes CDR1 y CDR2 del sistema ABC (superfamilia ATP binding cassette) y necesitan un bombeo especial con gasto de energía (35). Moran y Sanglar (34) han comprobado, en las cuatro cepas de C. dubliniensis con sensibilidad disminuida al fluconazol (8-64 mg/l) por ellos estudiadas, un aumento del RNAm del sistema MDR1. Por tratarse de C. dubliniensis lo denominan CdMDR1 y encuentran que tiene una homología del 96% con el de C. albicans (CaMDR1), así como la proteína transmembrana que codifica, CdMdr1p. Concluyen que el mecanismo de resistencia al fluconazol sería por sobreexpresióute;n del sistema de expulsión, como ya ha sido descrito para C. albicans (35, 36), y además apuntan que también puede existir una mutación en el citocromo P450 (que actúa como una 14-a-desmetilasa en la síntesis del ergosterol, cuya inhibición llevan a cabo los azoles), como también se ha demostrado en C. albicans (37-40). Esta resistencia se mantiene en los subcultivos libres de fluconazol, por lo que no es una resistencia epigenética sino, como ellos advierten, genéticamente estable (41). Probablemente en los próximos años quedará demostrado que la resistencia en C. dubliniensis es multifactorial, como en C. albicans, combinándose un aumento en la eliminación del fármaco, la mutación de la enzima diana, hiperproducción de la misma o alteración en la ruta metabólica en la síntesis del ergosterol (42-46). BIBLIOGRAFíA
Infecciones por Aspergillus spp.
J.M. Cisneros Herreros y E. Cañas García-Otero Servicio de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla. INREODUCCIÓN La aspergilosis invasora es una infección oportunista causada por hongos filamentosos del género Aspergillus, de difícil diagnóstico y de pronóstico muy grave. Frente a ella, los recursos terapéuticos actuales tienen una eficacia limitada. CARACTERÍSTICAS MICROBIOLóGICAS A. fumigatus ocasiona el 90% de los casos de aspergilosis invasora. Otras especies patógenas, como A. flavus, A. niger, A. terreus, A. nidulans y A. ustus, son mucho menos comunes (1, 2). La indentificación de la especie y la determinación de la sensibilidad de Aspergillus a los antifúngicos tiene cada vez mayor interés práctico para la epidemiología y para el tratamiento de la aspergilosis invasora. Se ha demostrado que existen diferencias de sensibilidad según la especie frente a itraconazol y otros azoles, y también frente a amfotericina, y que estas diferencias pueden condicionar el resultado del tratamiento de la aspergilosis invasora (3). PATOGÉNESIS Aspergillus spp. es un microorganismo de comportamiento oportunista. Necesita que el huésped esté debilitado para ocasionar enfermedad. De forma excepcional se han descrito casos en pacientes sin inmunodepresión conocida, pero por definición, en todo paciente con aspergilosis invasora se debe sospechar y buscar la presencia de alguna causa de inmunodepresión congénita o adquirida. Se conocen algunos mecanismos de patogenicidad de Aspergillus spp. La capacidad para crecer a 37 ºC es la principal característica que diferencia a las especies patógenas de las que no lo son. La patogenicidad se relaciona con la velocidad de crecimiento y, en general, a mayor velocidad mayor rapidez en la progresión de la aspergilosis invasora, de tal forma que A. fumigatus, que es la especie que crece más rápido, es también la más virulenta. La elevada resistencia de las esporas al medio ambiente y su pequeño tamaño (3-5 µm), que les permite llegar a los alvéolos pulmonares, son otros mecanismos que pueden contribuir a la patogenicidad (1, 4). Neutrófilos y macrófagos constituyen el sistema defensivo fundamental frente a la infección por Aspergillus. Los macrófagos capturan y destruyen las esporas que llegan al tracto respiratorio. Si se desarrollan las hifas, la ingestión celular no es posible porque las hifas son de gran tamaño, y su destrucción se lleva a cabo por la acción extracelular de los neutrófilos y los monocitos. Por lo tanto, todas las circunstancias que reducen la cantidad o la calidad funcional de estas células, como son el tratamiento con corticosteroides y la quimioterapia, aumentan la susceptibilidad a la infeccion por Aspergillus. La inmunidad humoral tiene un papel poco importante en la protección frente a la aspergilosis invasora (1). EPIDEMIOLOGÍA A. fumigatus es un hongo ubicuo de distribución mundial, tiene su nicho ecológico principal en el reino vegetal, especialmente en la vegetación en fase de descomposición. La aparición de aspergilosis invasora requiere de la exposición de un huésped susceptible a un inóculo suficiente. Ambos factores están inversamente relacionados. El principal mecanismo de transmisión es la vía aérea. Desde su reservorio inicial, las esporas de Aspergillus alcanzan la vía aérea o, en el caso del quirófano, el lecho quirúrgico (endocarditis, endoftalmitis), desde donde se pueden diseminar, germinar y producir la enfermedad. Otras puertas de entrada mucho menos frecuentes son la herida quirúrgica y el órgano trasplantado (5). La aspergilosis invasora se presenta en casos aislados o bien en brotes. Los brotes son de adquisición nosocomial y ocurren principalmente en los periodos de obras en los hospitales (6). La epidemiología molecular es imprescindible para el esclarecimiento de los brotes de aspergilosis invasora, ya que sólo mediante la comparación genética de los aislamientos clínicos y ambientales es posible la confirmación del origen común del brote o, en su defecto, la demostración de un pseudobrote, y por lo tanto para la aplicación de las medidas de control (7). La transmisión de persona a persona parece posible pero anecdótica. Se ha descrito un solo caso de posible transmisión de Aspergillus de una madre que padecía aspergilosis broncopulmonar alérgica a su hija, receptora de un trasplante renal (8). Con la excepción de las inmunodeficiencias congénitas, la aspergilosis invasora es básicamente una enfermedad que podemos definir como yatrógena, tributo por ahora obligado de los avances de la medicina. Los primeros casos de aspergilosis invasora se describieron en los años 1950 tras la utilización de los corticosteroides y la quimioterapia; por eso, la incidencia de la aspergilosis invasora ha aumentado de forma paralela al incremento de la población susceptible, incremento que se cifra en 14 veces en la última década según diagnósticos necrópsicos (9). Esta población está formada principalmente por tres grupos de pacientes: los receptores de trasplante de órgano sólido y de médula ósea; los pacientes oncohematológicos que reciben tratamientos citostáticos cada vez más agresivos; y los pacientes con sida, que constituyen un nuevo grupo de riesgo para las infecciones por Aspergillus. En los pacientes con sida se ha demostrado una reducción de la actividad antifúngica de los leucocitos polimorfonucleares frente a las hifas de Aspergillus en comparación con personas por lo demás sanas, lo que podría explicar los casos de aspergilosis invasora en pacientes sin neutropenia ni tratamiento con corticosteroides (10). Los grandes quemados, los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica y los pacientes con conectivopatías en tratamiento con fármacos inmunosupresores constituyen un grupo menor de pacientes inmunodeprimidos susceptibles a la infección por Aspergillus. Un tipo mucho menos común de aspergilosis invasora, que podríamos llamar quirúrgica, se ha descrito en pacientes inmunocompetentes intervenidos quirúrgicamente y con colocación de material protésico, en los que se contamina el lecho quirúrgico por Aspergillus spp. El más conocido ejemplo de aspergilosis invasora quirúrgica es la endocarditis protésica. Afortunadamente, la aspergilosis invasora es un infección poco común, cuya incidencia varía dependiendo del tipo de población de riesgo y del centro. La incidencia de aspergilosis invasora en los diferentes programas de trasplante de órgano sólido del Hospital Universitario Virgen del Rocío se recoge en la Tabla 1, y la incidencia de aspergilosis invasora en otros grupos de pacientes inmunodeprimidos en la Tabla 2. Los factores de riesgo para el desarrollo de aspergilosis invasora en pacientes hematológicos son la duración de la neutropenia, la quimioterapia de inducción y la enfermedad del injerto contra el huésped en los receptores de trasplante de médula ósea (13). En los receptores de trasplante de órgano sólido, el tratamiento del rechazo con dosis altas de corticosteroides, el tratamiento con OKT3, la insuficiencia renal y la disfunción del injerto hepático son los principales factores de riesgo de aspergilosis invasora (14, 15). Tabla1. Incidencia de aspergilosis invasoras en receptores de transplante de órgano sólido en el Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla Tabla2. Incidencias de aspergilosis invasoras en diferentes tipos de pacientes inmunodeprimidos(4). Tabla3. Características clínicas de la neumonía por Aspergillus en receptores de transplantes cardíacos(18) MANIFESTACIONES CLíNICAS La neumonía es la manifestación clínica más común de la aspergilosis invasora, con más del 90% de frecuencia. Otras manifestaciones como la rinosinusitis, la afectación cutánea, la endocarditis, la endoftalmitis y la enfermedad diseminada con afectación de prácticamente todos los órganos son mucho menos frecuentes (4, 16, 17). El periodo de incubación de la aspergilosis invasora es muy variable, desde pocos días hasta semanas, según el grado de susceptibilidad del huésped, y en menor medida según el inóculo, la localización y la especie de Aspergillus. Estos factores también determinan la forma de presentación clínica y la velocidad de progresión de la aspergilosis invasora, que va desde la neumonía difusa bilateral, de progresión rápida e invariablemente fatal, propia de los pacientes hematológicos con neutropenia profunda, hasta formas focales de presentación subaguda y curso indolente en pacientes menos debilitados. Las principales características clínicas de la neumonía por Aspergillus spp. en receptores de trasplante cardiaco se recogen en la Tabla 3. Ninguna de ellas es diagnóstica de aspergilosis, pero la expectoración hemoptoica es la manifestación más característica de la neumonía por Aspergillus comparada con las neumonías de otra etiología (54% vs. 6%, p <0.05) (18). La afectación del sistema nervioso central es, tras la neumonía, el síndrome clínico más característico de la aspergilosis invasora. Afecta al 14% de los pacientes con leucemia y aspergilosis, y es casi siempre una manifestación de enfermedad diseminada. La mortalidad es rápida y casi del 100% (19). MANIFESTACIONES RADIOGRáFICAS La evaluación radiológica de la aspergilosis invasora es esencial para la localización de la lesión y también en la elección de la técnica para la toma de muestras. Las principales manifestaciones radiográficas de la neumonía por Aspergillus se recogen en la Tabla 4. Ninguna de ellas es diagnóstica de aspergilosis, pero la cavitación es la manifestación más característica de la neumonía por Aspergillus comparada con la neumonía de otra etiología (38% vs. 4%, p <0.05) (18). En la Fig. 1 se presenta una radiografía de tórax con una lesión nodular cavitada. La tomografía computarizada (TC) es más sensible y precoz que la radiología convencional, y los signos del halo y del aire creciente son muy característicos de la aspergilosis pulmonar. En un estudio realizado en pacientes con fiebre y neutropenia, la TC comparada con la radiografía convencional permitió el diagnóstico precoz de la aspergilosis invasora (1,9 días frente a 7 días) y redujo la mortalidad en comparación con controles históricos. El signo del halo en la TC estuvo presente en el 82% de los casos, y el signo del aire creciente en el 18% (20). Tabla4. Características radiográficas de la neumonía por Aspergillus en receptores de trasplantes cardiaco(19). Figura 1. Radiografía de tórax de un paciente con leucemia y aspergilosis pulmonar, en la cual se observa la presencia de un nódulo cavitado. DIAGNÓSTICO El diagnóstico precoz de la aspergilosis invasora es difícil porque las manifestaciones clínicas son generalmente inespecíficas y ocurren en pacientes muy complejos, con múltiples posibilidades diagnósticas. Por ello se requiere un elevado índice de sospecha diagnóstica y gran experiencia con los diferentes grupos de pacientes susceptibles. Tras la identificación de la lesión o lesiones mediante la radiografía o la TC se debe proceder sin demora a la toma de muestras. En la neumonía, la broncoscopia con lavado broncoalveolar es el procedimiento de elección; una excepción son las lesiones nodulares, en las cuales la punción percutánea guiada por TC es la mejor técnica. Las muestras obtenidas deben ser procesadas para microscopia, cultivo y estudio histopatológico. La microscopia aumenta la rentabilidad del cultivo en un 15% a 20%, especialmente en pacientes con tratamiento previo, y sobre todo permite el diagnóstico en pocos minutos (21). El cultivo es necesario para la identificación de la especie de Aspergillus, para las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos y cuando sea preciso para el estudio molecular del aislamiento con fines epidemiológicos. El diagnóstico definitivo se realiza por la demostración de las hifas típicas de Aspergillus spp. en el estudio histológico o por su aislamiento en muestras estériles (líquido pleural, biopsia pulmonar). El aislamiento de Aspergillus spp. en las secreciones respiratorias no establece el diagnóstico de aspergilosis invasora, al ser un colonizante ocasional de las superficies cutaneomucosas, pero se asocia con ella en una proporción que varía entre el 72% en los pacientes con trasplante de médula ósea o neutropenia, el 56% en los receptores de trasplante de órgano sólido, el 63% en los pacientes en tratamiento esteroideo y el 14% en los pacientes con infección por el VIH (22). La rentabilidad de los hemocultivos en el diagnóstico de la aspergilosis invasora es prácticamente nula, incluso en pacientes con endocarditis. La aplicación de las técnicas de serología (en especial la determinación de antígenos de Aspergillus) y de la PCR al diagnóstico de la aspergilosis invasora está en fase de investigación clínica (23). Una técnica de PCR-ELISA realizada con muestras de lavado broncoalveolar alcanza una sensibilidad y especificidad del 100% en el diagnóstico de la aspergilosis pulmonar probable, según un estudio en pacientes con fiebre y neutropenia con sospecha de infección fúngica (24). Estos excelentes resultados necesitan su confirmación en estudios más amplios y sobre todo con inclusión de casos con diagnóstico de aspergilosis invasora confirmado. PREVENCIÓN Se ha intentado la prevención de la aspergilosis invasora con medidas para evitar la exposición ambiental a las esporas de Aspergillus. Aunque estas medidas se basan en un fundamento teórico razonable (si la inhalación de las esporas es el principal mecanismo de adquisión de la enfermedad, la reducción de la contaminación ambiental evitará la aspergilosis invasora), no se ha demostrado su eficacia en la reducción de la aspergilosis invasora. La exposición ambiental a las esporas de Aspergillus en los pacientes de riesgo se puede reducir mediante: Los sistemas de protección ambiental son muy eficaces en la reducción de la contaminación aérea por Aspergillus, pero son caros y el mantenimiento es complejo, y su eficacia en la reducción de la aspergilosis invasora no se ha demostrado (25). Por ello, el CDC recomienda (grado IB, basado en evidencias racionales y datos sugestivos de eficacia, pero sin estudios definitivos que lo demuestren) que los pacientes de alto riesgo, que define por neutropenia prolongada (<1000 PMN más de dos semanas) o profunda (<100 PMN una semana), sean ingresados en unidades con sistemas de protección ambiental con flujo dirigido, filtro de alta eficacia, presión positiva y sellado apropiado de puertas y ventanas. También recomienda (IB) que cuando los pacientes tengan que salir del ambiente protegido utilicen mascarillas capaces de filtrar las esporas de Aspergillus. Los cultivos de vigilancia ambiental, preferentemente por métodos volumétricos, sólo se recomiendan en caso de brote nosocomial (26). La profilaxis con antifúngicos es la otra estrategia preventiva ensayada con resultados contradictorios. Los aerosoles de amfotericina B no son eficaces en la prevención de la aspergilosis invasora en los pacientes con neutropenia prolongada y no son bien tolerados, como demuestra el único estudio aleatorizado realizado en pacientes con neutropenia prolongada (27). Los resultados de este estudio cuestionan los beneficios referidos en otro estudio previo, retrospectivo y de calidad inferior, realizado en receptores de trasplante pulmonar (28). La amfotericina liposomal por vía intravenosa no previene la aspergilosis invasora en los receptores de trasplante hepático ni de médula ósea, y en este grupo de pacientes tampoco disminuye la frecuencia de tratamiento empírico con antifúngicos (29, 30). TRATAMIENTO El tratamiento ideal de la aspergilosis invasora sería la combinación de antifúngicos, cirugía y recuperación del sistema inmunitario. La realidad es que el tratamiento antifúngico es poco eficaz y que las posibilidades de la cirugía y de la recuperación inmunitaria son limitadas. Tratamiento antifúngico El tratamiento antifúngico debe iniciarse lo antes posible. La amfotericina B desoxicolato es el fármaco de elección. La dosis es de 0,8-1 mg/kg/día desde el primer día de tratamiento, independientemente de la función renal. En los pacientes con neutropenia se recomiendan dosis de 1-1,25 mg/kg/día. Para reducir la nefrotoxicidad de la amfotericina se administran 500-1000 ml de suero salino cada día y se deben monitorizar las concentraciones de ciclosporina o de tacrolimus en los receptores de trasplante. La duración del tratamiento de la aspergilosis invasora se debe individualizar y en general se recomienda un mínimo de dos semanas. En una revisión de 244 pacientes procedentes de diversas series con aspergilosis pulmonar tratados principalmente con amfotericina, la tasa de respuesta o de supervivencia fue del 37% (31). Las formulaciones lipídicas de amfotericina B aprobadas en nuestro país, en complejo lipídico y liposomal, están indicadas en el tratamiento de la aspergilosis invasora en pacientes con fracaso o con intolerancia a la amfotericina desoxicolato. No existen estudios prospectivos y aleatorizados que las comparen con la amfotericina convencional en el tratamiento de la aspergilosis invasora. La amfotericina B en complejo lipídico fue la primera aprobada por la FDA para el tratamiento de la aspergilosis invasora en casos de intolerancia o fracaso de la amfotericina B, con una tasa de respuesta del 42% (32). Posteriormente la FDA licenció la amfotericina B de dispersión coloidal para el tratamiento de la aspergilosis invasora, y resultó más eficaz y menos tóxica comparada con un control histórico tratado con amfotericina desoxicolato (33). La amfotericina B liposomal ha sido la última formulación lipídica de amfotericina aprobada por la FDA. No hay estudios comparativos de la amfotericina desoxicolato con la forma liposomal en el tratamiento de la aspergilosis invasora. El único estudio comparativo entre ambos fármacos, aleatorizado y doble ciego, se ha realizado en el tratamiento antifúngico empírico de pacientes con fiebre y neutropenia. La eficacia es similar en ambos grupos de tratamiento, determinada por la supervivencia, la incidencia de aspergilosis invasora, la resolución de la fiebre y la retirada del tratamiento por toxicidad o ineficacia. En cuanto a seguridad, la amfotericina B liposomal es mejor tolerada, tiene menos nefrotoxicidad leve (19% vs. 34%, p <0.05) y menos efectos relacionados con la infusión (34). Otro estudio sobre el tratamiento de la aspergilosis invasora compara de forma aleatorizada dos dosis de amfotericina B liposomal, 1 mg/kg/día vs. 4 mg/kg/día, y concluye que las dos dosis son igual de eficaces, con respuesta clínica completa o parcial del 64% frente al 48% (p = NS) (35). La mayor limitación de este estudio es que sólo el 21% de los casos tiene el diagnóstico de aspergilosis invasora confirmado. La dosis recomendada para el tratamiento de la aspergilosis invasora con amfotericina B liposomal es de 3-5 mg/kg/día (4). El coste de las nuevas formulaciones lipídicas de amfotericina es muy elevado. En la Tabla 5 se detalla el coste del tratamiento por día con las diferentes formulaciones de amfotericina disponibles en nuestro país. Tabla 5. Precios y coste del tratamiento (en 1998) de la aspergilosis invasora con las diferentes formulaciones de amfotericina disponibles en nuestro país En resumen, a falta de estudios comparativos, las nuevas formulaciones lipídicas de amfotericina B son una alternativa para el tratamiento de la aspergilosis invasora en pacientes con intolerancia o fracaso de la amfotericina B desoxicolato (36, 37). El itraconazol oral (600 mg/día durante cuatro días seguido de 400 mg/día) se ha empleado en el tratamiento de la aspergilosis invasora con fracaso o intolerancia a la amfotericina, con una tasa de respuesta del 39% (38). La biodisponibilidad del itraconazol es muy variable, y bajas concentraciones en suero se han relacionado con fracaso terapéutico en estudios experimentales y con una tendencia a peores resultados en estudios clínicos, por lo que se aconseja su determinación plasmática (38, 39). La solución oral de itraconazol tiene mejor absorción. Recientemente se ha publicado un estudio clínico sobre la eficacia, seguridad y farmacocinética del itraconazol intravenoso seguido de la formulación oral en el tratamiento de la aspergilosis pulmonar. El resultado más importante del estudio es que en los primeros dos días de tratamiento el 91% de los pacientes alcanzaron concentraciones terapéuticas (>250 ng/ml) y la tasa de respuesta fue del 50% (40). Entre los nuevos fármacos con actividad frente a Aspergillus, el voriconazol es el más prometedor. Tiene una buena absorción por vía oral y presentación intravenosa. Su actividad in vitro frente a Aspergillus es mejor que la del itraconazol, e incluye a A. terreus, especie resistente a la amfotericina (41). Es superior al itraconazol en la prevención y el tratamiento de la endocarditis experimental por A. fumigatus (42). Se ha empleado con éxito en algunos casos de aspergilosis invasora refractarios a los tratamientos habituales (43) y se encuentra en fase de ensayo clínico avanzado. Tratamiento quirúrgico Bernard y cols. han modificado algunos conceptos sobre la indicación quirúrgica en la aspergilosis pulmonar en pacientes neutropénicos. Estos autores intervinieron a ocho pacientes de urgencia por una lesión en contacto con la arteria pulmonar, realizando en todos los casos una lobectomía. Lo innovador es que todos los pacientes presentaban neutropenia y también trombocitopenia moderada en el momento de la cirugía, pese a lo cual los resultados fueron excelentes: sólo un paciente falleció y la estancia hospitalaria fue corta. Estos autores proponen las siguientes indicaciones para el tratamiento quirúrgico en la aspergilosis invasora: a) resección urgente de las lesiones perihiliares, próximas a la arteria pulmonar, con riesgo de hemoptisis fatal; y b) resección electiva de las lesiones focales persistentes tras tratamiento antifúngico y recuperación de la neutropenia (44, 45). PRONóSTICO La aspergilosis invasora es una infección grave y a pesar de los avances terapéuticos su mortalidad sigue estando por encima del 50%, aunque con variaciones notables dependiendo del tipo de huésped y de la forma de presentación. La mortalidad de la aspergilosis pulmonar en los receptores de trasplante cardiaco es del 50%, en el trasplante renal del 70%, en el pulmonar del 77% y en el hepático del 92% (31). En la neumonía en receptores de trasplante cardiaco, Aspergillus spp. es por sí mismo un factor independiente de mal pronóstico (18). Los factores de mal pronóstico en la aspergilosis pulmonar son el mantenimiento de la situación de inmunosupresión, la neumonía bilateral, la hemoptisis grave, la demora del tratamiento antifúngico, las dosis bajas de amfotericina B y la ausencia de concentraciones plasmáticas adecuadas de itraconazol, y en los receptores de trasplante hepático la disfunción del injerto (4, 15). Recientemente se ha descrito que la sensibilidad de Aspergillus a la amfotericina puede ser un factor pronóstico importante de la aspergilosis invasora. Según datos de un estudio (3), la mortalidad de los pacientes con aspergilosis invasora con resistencia in vitro a la amfotericina (CMI ³2 mg/l) fue del 96% (22 de 23), y nula en los casos sensibles (6 de 6). Es necesario mejorar los pobres resultados del tratamiento actual de la aspergilosis invasora. Para ello se requieren medidas de prevención más simples y eficaces, métodos de diagnóstico precoz sensibles y específicos, la determinación, como norma, de la sensibilidad a los antifúngicos de Aspergillus spp. en los casos de aspergilosis invasora, y nuevos antifúngicos más eficaces y seguros. BIBLIOGRAFÍA
Antifúngicos clásicos: Peculiaridades farmacocinéticas de las nuevas formulaciones liposómicas y lipídicas
J.R. Azanza Perea Servicio de Farmacología Clínica, Clínica Universitaria de Navarra, Pamplona. INTRODUCCIóN Describir las características farmacocinéticas de cualquier medicamento suele ser una tarea ardua y habitualmente poco considerada por parte de los médicos prescriptores. Entre los motivos que justifican esta situación se encuentran la dificultad en la comprensión del significado de los conceptos y la falta aparente de aplicación práctica. Aceptando estas premisas resulta lógico que cualquier autor un poco avezado en estas tareas adopte algunas precauciones, como la explicación sistemática del significado clínico-práctico de cada uno de los parámetros descritos. Este intento puede resultar baldío o muy complejo cuando debe darse un sentido práctico a fármacos que presentan una características farmacocinéticas muy distintas a la habituales, prácticamente no descritas para ningún otro medicamento. El propio autor naufraga en un mar de dudas y puede caer en la tentación de recurrir a hipótesis, teorías no confirmadas, para intentar explicar hechos concretos. En este caso se encuadra la descripción de las características farmacocinéticas de las nuevas formas lipídicas de administración de un antifúngico clásico: la amfotericina B. Vaya por delante la solicitud de excusas ante la magnitud de los "agujeros negros" en la información y, sobre todo, en las posibles explicaciones contenidas en este artículo. NUEVAS FORMAS LIPíDICAS DE AMFOTERICINA B No es objeto de este artículo el ponderar las excelencias de un antifúngico tan antiguo con la amfotericina B en el tratamiento de las micosis profundas. Tampoco lo será describir las ventajas clínicas de las nuevas formas de amfotericina B, que se encuentran recogidas en multitud de trabajos de investigación. Nos centraremos especialmente en intentar describir las características de estas nuevas formulaciones y desde ellas justificar sus ventajas en eficacia y tolerabilidad. El mayor problema de la amfotericina B es que su eficacia se ve reducida por su toxicidad, dado que la incidencia y gravedad de los efectos adversos que produce hacen imposible la administración de dosis superiores a 1-1,5 mg/kg. Incluso cuando se administra esta dosis resulta muy frecuente la presencia de cuadros tóxicos agudos y de cuadros de nefrotoxicidad. La administración de este antifúngico en formas lipídicas especiales parece solucionar en parte el problema de la toxicidad renal, y permite la administración de dosis más elevadas (3-5 mg/kg), con lo que, a tenor de la experiencia clínica acumulada, aumenta la eficacia y la relación beneficio/riesgo de este fármaco. En los últimos años se han desarrollado diversas formas lipídicas de amfotericina B, sin olvidar que la forma convencional de este fármaco es también una forma lipídica: desoxicolato. De todas las existentes destacaremos las dos que actualmente están disponibles en nuestro país: la forma liposómica y el complejo lipídico. En la primera, la amfotericina B se encuentra depositada en el interior de liposomas formados por colesterol, fosfatidilcolina y diesteroilfosfatidilglicerol. Estos liposomas son de pequeño tamaño (<100 nm de diámetro), de forma característica y muy estables en medio acuoso. En la segunda forma, el complejo lipídico, la amfotericina se prepara como una suspension en 1-a-dimiristoilfosfatidilcolina y 1-a-dimiristoilfosfatidilglicerol. En esta suspensión la amfotericina B forma un complejo con los lípidos, adquiriendo una forma estable con una apariencia de cintas o bandas en las cuales la amfotericina B se alterna con los lípidos y sitúa los grupos hidrosolubles en el interior de la macroestructura. Se trata, por tanto, de formas con estructuras muy distintas que probablemente justifican el distinto comportamiento farmacocinético que pasaremos a describir a continuación. CONCENTRACIONES PLASMáTICAS Y PARáMETROS FARMACOCINéTICOS Desgraciadamente, por el momento no se han realizado estudios cruzados que comparen las características farmacocinéticas de estas formas, administradas a la misma dosis, en dosis única y en dosis múltiple, en los mismos voluntarios o pacientes. Más aún, existen grandes dudas sobre el tipo de muestra idónea para determinar las concentraciones de amfotericina B. Debe considerarse que la administración de las formas lipídicas implica que el fármaco contenido en ellas resulta ineficaz mientras no se libere de los lípidos; por ello, si se determina la concentración de amfotericina B en sangre total, ésta no puede relacionarse directamente con la eficacia, sobre todo si en la manipulación de la muestra no se evita la rotura de los liposomas con la correspondiente liberación artificial del fármaco activo. Si se determina la concentración de amfotericina B en plasma y los liposomas no se han roto, se tendrá constancia de la concentración de fármaco activo, pero se minimizará la importancia del fármaco asociado a los lípidos. Así pues, existe un problema no dilucidado, que ensombrece las posibilidades de estudiar el comportamiento farmacocinético, al menos mientras no se logre la estandarización del método de análisis. A pesar de todo y con las limitaciones lógicas, es posible adentrarse en terrenos aún especulativos pero sin duda de gran interés. Probablemente el mejor modo de iniciar la descripción es comparando los parámetros farmacocinéticos de la amfotericina B tras la administración del fármaco en sus formas convencional, liposomal y complejo lipídico, descritos por distintos autores, tanto cuando se administran en dosis única como cuando la administración se realiza en dosis múltiple (1, 2). Amfotericina B en complejo lipídico El comportamiento de la amfotericina B administrada en forma de complejo lipídico es distinto al de la amfotericina B en sus restantes formas. Tal y como puede apreciarse en la Tabla 1, la concentración plasmática máxima alcanzada con dosis casi idénticas es notablemente inferior. Este hecho parece explicarse por la presencia de un volumen de distribución muy elevado, característica que justifica que el área bajo la curva de concentraciones plasmáticas (AUC) resulte muy inferior a la alcanzada por la amfotericina B liposomal, a pesar de que la semivida de eliminación sea mucho más elevada. Además, cuando se comparan los parámetros obtenidos con dosis crecientes se comprueba la absoluta ausencia de linealidad, ya que la Cmáx y el AUC no se incrementan proporcionalmente a la dosis, y en algún caso la Cmáx es inferior con las dosis más elevadas. Resulta sorprendente que la depuración del fármaco y su volumen de distribución se incrementen de forma importante al aumentar la dosis administrada. Tabla 1. Parámetros farmacocinéticos de amgoreticina B tras la administración intravenosa de sus diferentes formas de presentación En resumen se trata de una forma de administrar amfotericina B que modifica de manera importante la farmacocinética del antifúngico, hasta el punto de que las concentraciones alcanzadas en sangre son bajas, el fármaco se distribuye muy ampliamente y, además, se elimina del organismo con gran lentitud. Otra característica inhabitual es que cuanto mayor es la dosis administrada mayor es la distribución del fármaco y menor la velocidad con que éste se elimina del organismo. Este comportamiento es totalmente atípico y casi podría afirmarse que se trata de un nuevo modelo de comportamiento farmacocinético. Quizás el hecho más sorprendente del comportamiento de la amfotericina B cuando se administra en forma de complejo lipídico es que el volumen de distribución sea tan elevado y además se incremente con la dosis. La explicación a esta característica puede encontrarse en el modo en que el organismo traslada las macropartículas lipídicas que contienen amfotericina B, mediante las células de la serie macrófago/monocito (SRE) tras un proceso previo de endocitosis (3-5). Estas células actúan una vez que el complejo lípido-amfotericina está presente en la sangre y no es posible su traslado mediante las lipoproteínas, ni fijado a otros tipos de células como los hematíes. El complejo así captado desaparece con gran rapidez del plasma dentro de las células del SRE, que pasarán a depositarse en los órganos donde habitualmente se acumulan estas células (hígado, bazo, pulmón, etc.), justicando a su vez concentraciones muy elevadas en estos órganos (5, 6). Posteriormente, el complejo es lentamente lisado, separándose el componente lipídico del antifúngico por acción de enzimas específicas del tipo fosfolipasa. Esta descripción explicaría el comportamiento especial del fármaco administrado en forma de complejo lipídico, puesto que justificaría su rápida desaparición del plasma, el depósito tisular intracelular, la larga semivida de eliminación e, incluso, el incremento del volumen de distribución asociado al aumento de la dosis, basándose en un supuesto mecanismo de estimulación de la actividad quimiotáctica de las células macrofágicas, ejercido por la presencia de cantidades elevadas del complejo en la sangre. Esta hipótesis ha sido en parte demostrada puesto que se ha comprobado la presencia de cantidades muy elevadas de amfotericina B dentro de células tipo macrófago, muy superiores a las alcanzadas en células de otras estirpes y, además, superiores a las que se logran al administrar dosis equivalentes de las formas de amfotericina B que presentan un volumen de distribución menor. Asimismo se ha observado que el tiempo de permanencia de la amfotericina B dentro de estas células es muy prolongado. La explicación anterior resulta tremendamente atractiva, incluso para justificar el notable incremento del índice terapéutico de esta forma de amfotericina B. Considérese que las células que contienen el fármaco en su interior en gran cantidad son, precisamente, las que alcanzan un especial protagonismo en la lucha contra las infecciones micóticas, presentándose en el lugar en que asienta la infección en gran cantidad y de forma inmediata. Si se ha administrado el fármaco estas células dispondrán de un arma de extraordinaria eficacia, la amfotericina B, contenida en ellas, que si es liberada en cantidad suficiente colaborará de forma definitiva para la erradicación del patógeno. No obstante, en este nivel existe un nuevo interrogante: ¿cómo se libera la amfotericina B de su unión a los lípidos? La tesis fundamentada en estudios in vitro señala que esta liberación se produce por efecto de fosfolipasas que degradan la superestructura ya dentro del macrófago, permitiendo la liberación del fármaco activo (7). Se ha descrito que existe gran cantidad de fosfolipasa en las localizaciones infecciosas (8). Como sucede siempre que se manejan estimaciones aproximadas, la realidad terapéutica será seguramente más compleja que la expuesta, dado que las cepas de Candida que presentan déficit de fosfolipasa pueden ser menos sensibles a la acción farmacológica de la amfotericina B en complejo lipídico, sensibilidad que se recupera al añadir fosfolipasa al medio de cultivo (9). In vivo, dichas cepas parecen seguir siendo sensibles a esta forma de amfotericina, lo que quedaría explicado por la existencia de otros tipos de enzimas capaces de deshacer la unión lípido-amfotericina B. La teoría se complica aún más cuando se considera la discrepancia que existe entre el mecanismo de transporte intracelular descrito y la eficacia clínica de esta forma de amfotericina B en el tratamiento de micosis profundas en pacientes neutropénicos. Cabría pensar que, en ausencia de leucocitos y con grave deterioro funcional de los macrófagos, la amfotericina B en complejo lipídico resultaría menos eficaz por fallo del mecanismo celular de transporte. La realidad es muy distinta y ello puede ser explicado por la utilización de otros medios de transporte, celulares o no, como lipoproteínas, que sustituyan a la acción de los habituales, o sencillamente porque resulten necesarias muy pocas células para transportar gran cantidad de fármaco. Debe considerarse que la dosis más alta recomendada por el momento es de 5 mg/kg (350 mg), y aun cuando ésta se administrase en bolo y no se produjese distribución alguna el fármaco, alcanzaría en plasma una concentración máxima de 70 mg/l. Esta concentración resulta aparentemente sencilla de transportar incluso cuando el número de células SER o su función resulten poco adecuados. Amfotericina B liposomal La administración de amfotericina B en forma de liposomas presenta unas características farmacocinéticas distintas. Destacan sus concentraciones plasmáticas elevadas, muy superiores a las alcanzadas por la forma convencional y lógicamente por el complejo lipídico, con un volumen de distribución mucho más reducido y un AUC muy elevada. Las diferencias, cuya traducción práctica resulta difícil de precisar, parecen deberse a una depuración plasmática más lenta, en la que también intervienen las células SRE. Es posible que el menor tamaño de esta forma lipídica, su carga negativa y especialmente su contenido de colesterol supongan un menor atractivo para las mencionadas células, que mediante fagocitosis/endocitosis captarían y transportarían estos liposomas, pero con mayor lentitud (10, 11). Este hecho explicaría el mayor tiempo de permanencia del liposoma en la sangre y con ello las concentraciones plasmáticas muy superiores y el AUC elevada, y lógicamente el reducido volumen de distribución. De forma típica parece que existe mayor linealidad entre dosis y parámetros farmacocinéticos con esta forma liposomal, ya que dosis superiores alcanzan concentraciones y AUC mayores, favorecido sin duda por la ausencia de variaciones en depuración, semivida o volumen de distribución, que permanecen constantes. ésta resulta una nueva diferencia respecto al complejo lipídico, que tal y como se comentó no presentaba linealidad. La explicación a esta diferencia puede encontrarse precisamente en la participación no estimulada de las células SER en el transporte tisular de la forma liposomal. La presencia en la sangre de mayor cantidad de liposomas no alteraría la velocidad de endocitosis ni supondría un estímulo para la quimiotaxis, lo que conduciría a una depuración plasmática constante e independiente de la cantidad de fármaco presente en la sangre. El liposoma, un vez internalizado, sería transportado en el interior de las células a los tejidos habituales (hígado, pulmón, etc.) y desde allí al tejido infectado. Curiosamente, algunos estudios en modelos animales han demostrado que la concentración de amfotericina B en el hígado es similar en el tiempo con ambas formulaciones. Este hecho, que supone una aparente contradicción con las diferencias en el transporte celular, podría ser explicado por la aparente capacidad de los liposomas de atravesar los sinusoides y capilares (12, 13), lo que supondría un factor sobreañadido al transporte celular en el caso de la forma liposomal. Nuevamente es necesario comentar el desarrollo de los acontecimientos inmediatos al efecto antifúngico, que necesariamente pasan por la liberación de la amfotericina B del liposoma. En el caso de esta forma parece que los lípidos del liposoma se fijan a la pared del hongo, produciéndose la liberación del fármaco activo ya en el interior de éste (14, 15). CONCLUSIONES Aunque nuestros conocimientos resulten insuficientes se pueden señalar algunos aspectos de gran interés: BIBLIOGRAFÍA
Los antifúngicos del año 2000
J.M. Torres-Rodríguez y Y. Morera Grup de Recerca en Micologia Experimental Clinica, IMIM, Universitat Autònoma de Barcelona. En el panorama de la terapéutica antifúngica para el siglo xxi se vislumbran novedades importantes. Para algunos productos, como el voriconazol, sólo falta conocer la fecha de comercialización, pero en otros todavía existen diversas etapas por recorrer. Más de un antifúngico prometedor no llegará a superarlas, y lamentablemente en algunos casos no será por deficiencias intrínsecas sino porque no parecen cumplir con las expectativas comerciales fijadas por las empresas farmacéuticas, que inicialmente destinaron grandes recursos materiales y humanos en investigación y desarrollo; éste es el caso de los inhibidores selectivos de proteínas fúngicas conocidos como sordarinas, inusual ejemplo de un fármaco antifúngico con marcada actividad contra levaduras y Pneumocystis carinii. Además de las nuevas moléculas que tienen su efecto sobre dianas conocidas, como el citocromo P-450, sobre el que actúan los azoles, también se encuentra avanzada la investigación de los fármacos que tienen su blanco en la pared fúngica, como las equinocandinas. La búsqueda de nuevos productos incluye la mejora galénica de los existentes que ya han demostrado su eficacia; tal es el caso de la amfotericina B y sus nuevas presentaciones, como la microencapsulada en nanosferas, la asociada al cocleato o al b-arabinogalactano, y la nistatina asociada a liposomas. La terbinafina, de uso casi exclusivo en dermatofitosis, ha demostrado que también es útil para tratar algunas micosis profundas, tanto subcutáneas como sistémicas. Una importante asignatura pendiente es conocer la aplicabilidad y utilidad concreta de asociaciones de antifúngicos con distintos mecanismos de acción. Azoles Resulta inminente la disponibilidad de productos con mayor actividad y espectro que los existentes. El voriconazol, de administración oral e intravenosa, además de en levaduras es activo sobre Aspergillus spp., y ensayos clínicos controlados han demostrado su eficacia en enfermos inmunosuprimidos afectados de aspergilosis invasora, criptococosis o candidosis sistémica. La dosis efectiva es de 200 mg cada 12 horas, que se asocia con una buena tolerabilidad. Otros triazoles con un perfil parecido son el posaconazol (SCH 56.592), el ravuconazol (BMS 207.147), T-8581 y D0870, en fases más atrasadas de estudio.
Polienos Entre las formulaciones lipídicas de nuevo diseño destacan la nistatina liposomal, de similar espectro que la forma libre, pero que admite su administración intravenosa a dosis de 2-4 mg/kg/día con una tolerabilidad mejor que la de la amfotericina B desoxicolato. Posiblemente el principal avance en este grupo de antifúngicos es la absorción digestiva de la amfotericina B, que sería posible al asociarse al cocleato. Péptidos Entre ellos destaca la caspofungina (Cancidas-MK 0991/L-743,872), nueva equinocandina activa sobre Candida, Aspergillus y P. carinii. Su administración intravenosa en modelos experimentales de aspergilosis y en enfermos con candidosis orofaríngea ha mostrado su eficacia y seguridad. Otros derivados peptídicos son los inhibidores de la quitina sintetasa como la nikkomicina, disponible para el tratamiento exclusivo de la coccidiodomicosis, el FK 463 7 y el LY 303.666; con este último al parecer se han suspendido los ensayos en curso. Se está demostrando que en el campo del tratamiento de las micosis todavía queda mucho camino por recorrer. La disminución de las micosis en enfermos de sida, comprobada en los países económicamente avanzados que pueden aplicar las nuevas terapias antirretrovirales, no debería constituir un freno para las empresas farmacéuticas, que además de obtener beneficios deberían contribuir decisivamente al desarrollo de nuevos antifúngicos que siguen siendo imprescindibles para controlar y curar las graves micosis sistémicas que todavía no disponen de un tratamiento suficientemente adecuado.
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