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Desarrollo de nuevos procedimientos para el diagnostico de la enfermedad de Chagas con utilidad para establecer el pronóstico y la evolución post-tratamiento

Autores:
M. Carmen Thomas. Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra. Granda. España
Ana I. Fernández-Villegas. Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra. Granda. España
Bartolomé Carrilero Fernández. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Daniel Saura. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Manuel Segovia Hernández. Hospital Universitario"Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Manuel Carlos López*. Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra. Granada. España

Introducción: La enfermedad de Chagas es endémica del continente americano, y afecta, con elevados índices de morbilidad y mortalidad, a más de 10 millones de personas. El actual flujo migratorio ha hecho de ésta una enfermedad emergente en nuestro entorno. Actualmente, se cifra en más de 40.000 los casos de Chagas existentes en España. La enfermedad de Chagas en su fase crónica involucra  una fase indeterminada asintomática, que compromete cerca del 40% de los casos serológicamente positivos, y una fase sintomática con patología grave cardiaca y/o digestiva. El tratamiento con benznidazol es muy efectivo en pacientes en fase aguda, sin embargo, en fase crónica su efectividad no está aún demostrada. El diagnóstico se realiza, principalmente, mediante técnicas serológicas, mostrando tener una alta sensibilidad y especificidad, pero estos resultan poco útiles para evaluar el estatus clínico del paciente, así como la evolución de éste tras tratamiento.

 Material y métodos: Se evalúa la reactividad, mediante la técnica de ELISA, de sueros de pacientes de Chagas en distintas fases de la enfermedad, controles sanos y pacientes con enfermedades que pudieran presentar co-reactividad, frente a un grupos de proteínas recombinantes y péptidos sintéticos correspondientes a antigenos/epítopes antigénico de Trypanosoma cruzi, agente responsable de la enfermedad de Chagas. 

 Resultados: Se observa que, tanto los pacientes con Chagas crónico en fase indeterminada como aquellos con sintomatología cardiaca o digestiva presentan un nivel de anticuerpos, frente a los antígenos KMP11, HSP70, PFR2, Tgp63 de T. cruzi  es superior y estadísticamente significativo, que aquél detectado en donantes sanos. Así mismo, se observó que los pacientes de Chagas a estudio mostraron un descenso, estadísticamente significativo, en el nivel de anticuerpos específicos frente a los antígenos KMP11, HSP70 y PFR2 a los seis y nueve meses post-tratamiento con benznidazol. Sin embargo, el reconocimiento de los antígenos totales solubles del parásito (STcA), resultó invariable en los pacientes durante el seguimiento tras el tratamiento.

Así mismo, se ha caracterizado una secuencia peptídica, denominada 3973, contenida en la proteína TcCA2 de la membrana de T. cruzi, la cual es reconocida por enfermos de Chagas crónico con una sensibilidad superior al 90% y una especificidad superior al 98%. Además, hemos observado que los pacientes en fase crónica sintomática (CCC y DIG) presentan una tasa de anticuerpos frente al péptidos 3973 superior, con significancia estadística, al presente en los pacientes crónicos en fase indeterminada (IND).  

Conclusiones: El estudio de la reactividad frente a las proteínas recombinantes descritas e identificadas puede ser útil para la monitorización de la efectividad del tratamiento con benznidazol de pacientes de Chagas. Así mismo, se ha identificado una molécula útil como  indicador de progresión de la enfermedad de Chagas. 

Financiación: El estudio ha sido financiado por los proyectos P08-CVI-04037PAI (Junta de Andalucía), RD06/0021/0014 y RD06/0021/1007 ISCIII-RETIC (MICINN) y FEDER.

Palabras clave: Enfermedad de Chagas; Antígenos recombinantes; Trypanosoma cruzi

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Rápido aclaramiento de la parasitemia en pacientes con enfermedad de Chagas crónica durante el tratamiento con benznidazol

Autores:
María José Muñoz Dávila. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Laura Murcia Flores*. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Bartolomé Carrilero Fernández. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Manuel Segovia Hernández. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España

OBJETIVOS: El beneficio del tratamiento farmacológico en pacientes con enfermedad de Chagas crónica (ECC) continúa siendo controvertido. La PCR ha demostrado ser una herramienta útil en la monitorización de la respuesta terapéutica en pacientes con ECC tratados con benznidazol. Murcia et al. (2010) demostraron un aclaramiento de la parasitemia en el 100% de los pacientes estudiados a los 90 días post-tratamiento con benznidazol. El objetivo del presente estudio fue determinar el momento de negativización de la parasitemia mediante PCR durante el tratamiento con benznidazol en una cohorte de pacientes chagásicos crónicos en zona no endémica.

MATERIAL Y METODOS: Un total de 19 pacientes adultos diagnosticados de ECC, fueron incluidos en el estudio. El diagnóstico de enfermedad de Chagas se estableció en base a los criterios de la OMS mediante el resultado positivo de dos técnicas serológicas (IFI y ELISA). De estos pacientes, 6 (31,6%) eran sintomáticos, 3 (15,8%) presentaban sintomatología cardiaca, 2 (10,5%) digestiva y 1 (5,3%) ambas. Los pacientes se trataron con benznidazol, 5-7mg/kg/día en tres tomas diarias durante 60 días. Se tomaron muestras el día de inicio del tratamiento y a los 15, 30, 60 y 90 días post-tratamiento. La detección del parásito por PCR se realizó según protocolo descrito por Murcia et al. 2010.

RESULTADOS: De los 19 pacientes incluidos en este estudio, 14 presentaron un resultado de PCR positivo antes del tratamiento y 5 un resultado negativo. Todos los pacientes cuyo resultado de PCR al inicio del tratamiento fue positivo presentaron un resultado negativo a los 15 días tras inicio del tratamiento, excepto uno. Este paciente, observó correctamente el tratamiento y presentó negativo su control de PCR a los 30 días post-tratamiento. Ningún otro control post-tratamiento resultó positivo.

CONCLUSIONES: El tratamiento con benznidazol en pacientes con enfermedad de Chagas crónica produce un rápido aclaramiento de la parasitemia en la mayoría de estos durante los primeros 15 días de tratamiento. La PCR resulta una herramienta útil para detectar fallos terapéuticos tempranos durante el tratamiento con benznidazol.

FINANCIACION: RICET  ref: RD06/0021/1007. FIS ref: PS09/01956.

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Palabras clave: PCR; Respuesta al tratamiento; Benznidazol;

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Efectos secundarios en pacientes con enfermedad de Chagas tratados con nifurtimox

Autores:
Laura Murcia Flores. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Bartolomé Carrilero Fernández*. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
María José Muñoz Dávila. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España
Manuel Segovia Hernández. Hospital Universitario "Virgen de la Arrixaca". Murcia. España

INTRODUCCION: Nifurtimox y benznidazol, son los dos únicos fármacos disponibles para el tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas. Ambas drogas producen efectos secundarios forzando en algunas casos la suspensión del tratamiento. A continuación describimos nuestra experiencia en el tratamiento con nifurtimox y seguimiento de los pacientes con enfermedad de Chagas diagnosticados en la Unidad Regional de Medicina Tropical de Murcia (URMTM).

MATERIAL Y METODOS: Un total de 26 pacientes adultos han recibido tratamiento con nifurtimox (8-10mg/Kg/día en tres tomas diarias durante 90-120 días). El nifurtimox se utilizó como tratamiento primera elección cuando el benznidazol no estuvo disponible (11 pacientes), cuando los pacientes presentaron reacciones adversas al benznidazol que forzaron la suspensión del tratamiento (12 pacientes) o cuando se produjo un fallo terapéutico (3 pacientes).

RESULTADOS: Los 26 pacientes completaron el tratamiento con nifurtimox. De estos, 16 (61.5%) pacientes presentaron reacciones adversas, mostrando 12 (10 de 21, 47.6%) más de una. La tabla muestra los efectos secundarios en los pacientes tratados con nifurtimox. 

CONCLUSION: El conocimiento de los efectos secundarios al tratamiento con nifurtimox en un área donde la enfermedad de Chagas no es endémica, facilitará su manejo terapéutico y a su vez, la correcta observancia del tratamiento.

 

Nº/Total

%

Pacientes que presentaron reacción adversa/nº de pacientes tratados

16/26

61.5

Reacciones adversas en los pacientes tratados con nifutimox

Nº/Total

%

Intolerancia digestiva

Náuseas

Vómitos

Epigastralgia

Disfagia

6/26

1/26

1/26

1/26

23.1

3.8

3.8

3.8

Anorexia

5/26

19.2

Pérdida de peso

2/26

7.7

Alteraciones del gusto (sabor metálico en las comidas)

1/26

3.8

Pérdida de memoria

5/26

19.2

Polineuritis

1/26

3.8

Temblor

1/26

3.8

Cefalea

1/26

3.8

Astenia

2/26

7.7

Insomnio

1/26

3.8

Palpitaciones

1/26

3.8

Poliartralgias

2/26

7.7

Eritema

Prurito

2/26

1/26

7.7

3.8

 FINANCIACION RICET ref: RD06/0021/1007. Fondo de Investigación Sanitaria FIS ref: PS09/01956.

Palabras clave: Nifurtimox; Enfermedad de Chagas; Trypanosoma cruzi;

 

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IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli AISLADOS DE HECES MEDIANTE LA PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DEL HIPURATO

Autores:
María Almagro Moltó*. Hospital General Universitario de Móstoles. Móstoles. España
Nuria Sanz Rodríguez. Hospital General Universitario de Móstoles. Móstoles. España
Cristina Simón Baamonde. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda. España
Jose Luis Gómez Garcés. Hospital General Universitario de Móstoles. Móstoles. España
María Teresa Pérez Pomata. Hospital General Universitario de Móstoles. Móstoles. España

Introducción y objetivos

En los países industrializados las bacterias pertenecientes al género Campylobacter constituyen la primera causa de gastroenteritis bacteriana.  C.jejuni es la única especie del género que hidroliza el hipurato, por ello esta prueba es la más utilizada para la identificación de los aislamientos de heces. Sin embargo, se han descrito cepas de C. jejuni carentes de actividad hipuricasa y aislados de C. coli falsamente positivos. Nakari y cols. (2008) demostraron que la incubación durante cuatro horas de un inóculo de densidad 6 a 10 en la escala de McFarland realizado a partir de un subcultivo en agar sangre evita la aparición de falsos positivos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar los resultados obtenidos con la prueba del hipurato realizada a partir de un medio selectivo de aislamiento primario (CCDA) empleando como referencia el método recomendado por Nakari.

 Material y método

Se incluyeron 69 cepas obtenidas de heces recogidas durante el año 2010.  Se estudió la producción de hipuricasa directamente del aislamiento primario en CCDA y de un subcultivo en agar sangre (AS). Cuando se dispuso de colonias suficientes se realizó una suspensión de densidad 6 a 10 en la escala de McFarland  (inóculo adecuado) en un tubo con 1 ml de hipurato sódico en solución acuosa. Se hicieron dos alícuotas de 0.5 ml que se incubaron dos y cuatro horas. Para revelar la reacción se añadieron cuatro gotas de ninhidrina. Cualquier intensidad de color azul se consideró positiva a los 10 minutos y positiva débil a los 20. Cuando no fue posible alcanzar un inoculo de densidad 6 de McFarland  (inóculo insuficiente) el procesamiento fue el mismo. Como controles positivo y negativo se emplearon C.jejuni  ATCC 33560 y un aislado de C.coli identificado mediante una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa (Mateo y cols., 2005). Las cepas negativas según el método de Nakari fueron identificadas con la antedicha técnica de PCR.

Resultados

Cuatro cepas fueron identificadas como C.coli y 65 como C.jejuni. El 38% de los inóculos realizados a partir de CCDA fueron insuficientes y el 12% de los resultados obtenidos de ellos a las cuatro horas de incubación fueron incorrectos. Sin embargo, cuando los inóculos fueron adecuados (62%) la concordancia de los resultados con los del método de referencia  fue del 98% a las cuatro horas de incubación. Con el método de Nakari la concordancia entre los resultados obtenidos a las dos y cuatro horas de incubación fue del 100%.

Conclusiones

Según nuestra experiencia la prueba de la hidrólisis del hipurato realizada a partir de la placa de CCDA tiene una precisión del 98% siempre que se obtenga un inóculo adecuado y se incube 4 horas. De acuerdo con nuestros datos el método recomendado por Nakari proporciona resultados superponibles a las dos y cuatro horas de incubación, por lo que cada laboratorio podría emplear el tiempo que mejor se adapte a su sistemática de trabajo.

Palabras clave: Campylobacter sp.; Hidrólisis del hipurato;

 

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 Búsqueda activa de infecciones por Strongyloides stercoralis en pacientes del Hospital Universitario Insular de Gran Canaria.

Autores:
Antonio Manuel Martín Sánchez*. Servicio de Microbiología*. Hospital Universitario Insular de Gran Canaria. Las Palmas de Gran Canaria. España
José Luis Pérez Arellano. Unidad de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical** HUIGC. Las Palmas de Gran Canaria. España
Ana de Malet Pintos-Fonseca. HUIGC*. Las Palmas de GranCanaria. España
Cristina Carranza Rodríguez. HUIGC**. Las Palmas de Gran Canaria. España
Araceli Hernández Betancor. HUIGC*. Las Palmas de Gran Canaria. España
Otilia Évora Santana Rodríguez. HUIGC*. Las Palmas de Gran Canaria. España

Introducción: Strongyloides stercoralis es un nematodo capaz de parasitar  a personas que residen en zonas tropicales y subtropicales. En España existen dos formas epidemiológicas diferentes: casos autóctonos (p. ej. en Valencia) y formas importadas en inmigrantes. En los pacientes inmunocompetentes la triada característica consiste en lesiones cutáneas (p. ej larva cutánea currens), digestiva (datos inespecíficos) y eosinofilia (hasta en el 70% de los infectados). Este cuadro puede persistir mucho tiempo debido a que el ciclo vital del parásito incluye la autoinfección. En pacientes inmunodeprimidos, la diseminación masiva de las larvas filariformes asociadas a bacterias entéricas da lugar a una sepsis, a menudo con desenlace fatal. No existe un patrón áureo en el diagnóstico de esta entidad. Objetivo: Describir casos detectados de junio de 2006 a diciembre de 2010 y evaluar  técnicas diagnósticas.                

Material y método: Análisis retrospectivo observacional de los estudios parasitológicos en heces realizados durante el período 2006-2010. El estudio coproparasitario se realizó mediante las técnicas de Ritchie y Kato.  De cada muestra se depositó una cantidad de heces del tamaño de un guisante en agar de Mueller Hinton. Los cultivos se incuban a 25ºC y se observan cada 24 horas buscando las trayectorias sinuosas.                                                                                      

Resultados: Se procesaron un total de 1575 muestras de heces correspondientes a 595 pacientes (2,6 muestras/paciente). Se diagnosticaron nueve casos de infección por S. stercoralis (1,5%). El primer caso correspondía a un paciente, natural de la isla de Gran Canaria, sometido a transplante renal (inmunodeprimido). Refería haber vivido en Cataluña durante varios años y también hace años en Madeira. El resto de los pacientes eran emigrantes procedentes de Senegal, Colombia, Tanzania, Gambia, Guinea Bissau, República Dominicana, Guinea Conakry y Venezuela. En tres de los pacientes se detectó otro parásito: Ascaris lumbricoides, Schistosoma mansoni, y Plasmodium falciparum.  Todos los pacientes presentaban eosinofilia excepto el coinfectado por Plasmodium. Únicamente un paciente refería la triada característica.

Año

Sujetos estudiados

Casos positivos (Global)

Casos positivos (Ritchie)

Casos positivos(Kato)

Casos positivos (Cultivo)

2006

80

1

0

0

1

2007

216

1

1

0

1

2008

190

3

2/3

0

3/3

2009

72*

1

0

0

1

2010

37*

3

2/3

1/3

3/3

Total (%)

595

9

5 (55%)

1 (11%)

9 (100%)

* Sólo estudiados pacientes con eosinofilia.        Todos los casos fueron tratados con ivermectina.                        

Conclusiones: 1) La presencia de eosinofilia, aumenta la probabilidad preprueba para el diagnóstico de esta entidad. 2) La coinfección por Plasmodium spp  hace desaparecer transitoriamente la eosinofilia. 3) El método directo más sensible es el cultivo de heces en agar de Mueller Hinton, siendo una técnica sencilla y económica.

Palabras clave: Strongyloides stercoralis, cultivo, eosinofilia;

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Prevalencia y sensibilidad de la uretritis gonocócica en un hospital del sur de Madrid (2006-2011)

Autores:
Nuria Sanz Rodríguez*. Hospital Universitario de Móstoles. Móstoles. España
Raquel Abad. Centro Nacional de Microbiología.Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda. Madrid. España
María Almagro Moltó. Hospital Universitario de Móstoles. Móstoles. España
María Teresa Pérez Pomata. Hospital Universitario de Móstoles. Móstoles. España
José Luis Gómez-Garcés. Hospital Universitario de Móstoles. Móstoles. España

Introducción y objetivos

Neisseria gonorrhoeae (NG) ha demostrado ser capaz de desarrollar resistencia a varios de los antimicrobianos empleados en el tratamiento. El objetivo del presente estudio fue conocer la prevalencia de uretritis gonocócica en nuestro hospital y la sensibilidad antibiótica de los aislados e identificar los servicios de nuestra área a los que acuden los pacientes con esta patología.

Material y métodos

Se revisaron los resultados del cultivo de 1214 exudados uretrales procedentes de otros tantos varones con síntomas o signos sugerentes de uretritis que consultaron durante el periodo comprendido entre enero de 2006 y junio de 2011. Las muestras fueron inoculadas en agar sangre, agar chocolate y agar Thayer-Martin. Las placas fueron incubadas hasta 72 horas a 37ºCen atmósfera enriquecida con CO2 al 5%. La identificación a nivel de especie se realizó mediante tinción de Gram, catalasa, oxidasa y galería API NH® (bioMérieux). Los aislados fueron remitidos al Centro Nacional de Microbiología para su tipado y estudio de la sensibilidad frente a penicilina, tetraciclina, ceftriaxona y ciprofloxacino. La metodología seguida para la determinación de las CMIs fue dilución en agar, metodología que está sometida a controles de calidad externos del European Center for Disease Control (ECDC).

Resultados

Obtuvimos 70 cepas de NG procedentes de las 1214 muestras procesadas (5,8%).La media de aislamientos de NG entre 2006 y 2009 fue 9,5 (rango: 7-12). El número de aislados en 2010 fue 28, lo que supone un incremento estadísticamente significativo (p<0.005) en relación con los años anteriores. En los seis meses de 2011 analizados se obtuvieron 4 aislamientos.

Se estudió la sensibilidad de 57 cepas. De acuerdo con los puntos de corte del CLSI, 25 cepas fueron resistentes a penicilina (44%), 29 fueron resistentes a tetraciclina (51%) y 33 fueron resistentes a ciprofloxacino (58%). No se aisló ninguna cepa resistente a ceftriaxona.Las solicitudes de los cultivos en los que se aisló NG procedían de médicos de atención primaria (73%), de consultas hospitalarias (17%) y de urgencias hospitalarias (10%).

Conclusiones

Detectamos un aumento significativo de las uretritis gonocócicas en el año 2010. El análisis de las serovariedades de las cepas sugiere un brote o un agrupamiento de casos durante el 2010, debido probablemente a la diseminación de la infección a partir de uno o varios pacientes tardía o incorrectamente tratados. De los 28 casos, 12 pertenecían a la misma serovariedad (IB pyut). Este dato resulta llamativo con respecto a otros años, en los que no se aisló ninguna cepa de esta serovariedad. En los seis meses de 2011 analizados la tendencia al alza no parece mantenerse.  Dado que más de la mitad de las cepas de NG aisladas en nuestro medio son resistentes a ciprofloxacino, el tratamiento empírico de la uretritis gonocócica debe ser ceftriaxona. En nuestra área la mayoría de los pacientes con uretritis gonocócica acuden a su centro de salud. Sería deseable que todos los médicos implicados en la atención de los pacientes con infección gonocócica tuviesen información actualizada sobre el estado de las resistencias de NG en nuestro medio.

Palabras clave: Neisseria gonorrhoeae; Uretritis gonocócica;

 

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Subanálisis de estudio retrospectivo y multicéntrico para evaluar la función renal en pacientes con EPOC ingresados en servicios de cuidados intensivos y tratados con anfotericina B liposomal

Autores:
M. Rodríguez*. Hospital Infanta Leonor. Madrid. España
M. C. Soriano. Hospital La Paz. Madrid. España
M. Catalán. Hospital 12 de Octubre. Madrid. España
A. Llorente. Hospital 12 de Octubre. Madrid. España
N. Vidart. Hospital Clínico San Carlos. Madrid. España
F. Álvarez-Lerma. Hospital del Mar. Barcelona. España

Introducción: Anfotericina B liposomal (AmB-L) se emplea en pacientes críticos para el tratamiento empírico o dirigido de hongos filamentosos o levaduras.

Objectivos: Evaluar la seguridad renal de AmB-L en pacientes con EPOC ingresados en UCIs de centros españoles.  

Materiales y métodos: Se partía de un estudio en pacientes ingresados en UCI y tratados con AmB-L durante al menos 3 días, por cualquier motivo. Para este subanálisis se ha definido como “caso de estudio” los  pacientes con EPOC que no han utilizado técnicas de depuración extrarenal durante el tratamiento con AmB-L.

Resultados: Se incluyeron un total de 37 pacientes procedentes de 21 UCIs. Al ingreso, la media del Apache II era 21,4 ± 7,5. Al inicio del tratamiento con AmB-L, el 100% de los pacientes portaba catéter venoso central y sonda vesical, el 89,2% había recibido antibióticos en los 7 días previos, el 84,2% tenía una vía arterial, el 86,5% requería ventilación mecánica y nutrición parenteral total el 62,2%.

AmB-L fue empleada fundamentalmente por su amplio espectro y la inestabilidad hemodinámica de los pacientes, siendo administrada como primera línea de tratamiento en el 56,8% de los casos (21 pacientes). La duración media del tratamiento con AmB-L fue 12,2 ± 5,9 días y la dosis media administrada fue 3,1 ± 1,0 mg/kg/día. La creatinina al inicio del tratamiento con AmB-L era igual o menor a 1,5 mg/dl en el 64,9% de los pacientes (24 de 37). Al final del tratamiento con AmB-L, el 91,7% de los pacientes con creatinina igual o menor a 1,5 mg/dl al inicio de éste continuaban con valores iguales o inferiores a 1,5 mg/dl. Al inicio del tratamiento la creatinina media fue de 1,71 ± 1,5 mg/dl que descendió a 1,40 ± 1,0mg/dl al final del tratamiento con AmB-L (p=0.089). Evaluando en porcentajes, al final del tratamiento se produjo un descenso o se mantuvo igual en el 67.57% de los pacientes. A pesar de que el 66,7% de los pacientes (24 de 36) estaba siendo tratado con fármacos nefrotóxicos concomitantes solo se produjo un aumento de la creatinina 2 veces el valor basal  en 2 pacientes (5.41%). Ningún paciente abandonó el tratamiento por nefrotoxicidad u otra, ni se produjeron acontecimientos adversos graves.

Conclusiones: La función renal en pacientes con EPOC ingresados en UCIs no se vió alterada durante el tratamiento con AmB-L, sin observarse abandonos por toxicidad renal a pesar del uso de fármacos nefrotóxicos concomitantes. Aunque la muestra de pacientes es escasa, los datos sugieren que AmB-L se puede administrar de forma segura a pacientes críticos con EPOC.

Palabras clave: EPOC; anfotericina B liposomal; seguridad renal;

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DISEÑO DE UN MODELO EXPERIMENTAL PARA ESTUDIAR EL EFECTO DE LOS ANTIMICROBIANOS EN POBLACIONES BACTERIANAS ORGANIZADAS

Autores:
Fernando Gomez-Aguado. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
Maria Teresa Corcuera. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
David Sevillano. Dpto. Medicina-Microbiología, F. Medicina UCM. Madrid. España
Luis Alou. Dpto. Medicina-Microbiología, F. Medicina UCM. Madrid. España
M. José Alonso. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
José Prieto*. Dpto. Medicina-Microbiología, F. Medicina UCM. Madrid. España

INTRODUCCIÓN. Los estudios in vitro de sensibilidad a los antimicrobianos (antibiograma, CMI, CMB) se utilizan como predictores de actividad. Por otro lado, es aceptada la mala actividad de los antimicrobianos en el biofilm por su baja penetración, alta concentración bacteriana en diferentes fases de crecimiento, etc. En las colonias sucede algo similar (subpoblaciones estratificadas en diferentes fases de crecimiento y alta concentración bacteriana). De este modo, la colonia podría ser un modelo de estudio para predecir la actividad de antimicrobianos en un biofilm.

MATERIAL Y MÉTODOS. Se utilizaron dos cepas de S. aureus: 1) S. aureus ATCC 29213, sensible a vancomicina (CMI = 1 mg/l) y a cloxacilina (CMI = 0,25mg/l); 2) cepa Mu3,  hVISA (CMI = 2 mg/l) y resistente a cloxacilina (CMI > 1.024 mg/l). Una suspensión bacteriana de aproximadamente 108 UFC/ml fue diluida y sembrada en filtros de 0.45 µm para la obtención de colonias aisladas. Los filtros se incubaron sobre agar Mueller-Hinton a 35ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, los filtros se incubaron sobre agar Mueller-Hinton con distintas concentraciones de vancomicina (1, 2 y 16 mg/l) y cloxacilina (0.06, 0.25, 1 y 256 mg/l) a 35ºC durante 24, 48 y 72 horas adicionales. En todos los casos se procesaron controles sin antibióticos. Finalizados los tiempos de incubación, se midieron los diámetros de las colonias con un sistema de análisis de imagen y se procesaron colonias aisladas siguiendo un protocolo de inclusión en resina epoxi para el estudio de secciones transversales por microscopía óptica y electrónica previamente descrito.

 RESULTADOS. No se encontraron diferencias, ni en tamaño ni en estructura, entre las colonias control y las colonias tratadas con vancomicina, independientemente de la concentración de antibiótico y del tiempo de incubación, en las dos cepas estudiadas.

Las colonias de la cepa Mu3 tampoco presentaron alteraciones al ser tratadas con cloxacilina. Lo mismo ocurrió con la cepa ATCC 29213 con concentraciones de cloxacilina iguales o inferiores a 0.25 mg/l. Sin embargo, en presencia de concentraciones iguales o superiores a 1 mg/l, las colonias detuvieron su crecimiento y experimentaron profundas alteraciones estructurales, consistentes en la encapsulación de la zona central de la colonia y un posterior recrecimiento a partir de ese núcleo central que acababa recubriendo la colonia original.

CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN. La metodología descrita puede aportar información valiosa sobre el efecto de los antimicrobianos en comunidades bacterianas con elevada densidad poblacional y compleja organización, complementando los datos de sensibilidad y contribuyendo a explicar los efectos observados in vivo. Así, nuestros resultados ponen de manifiesto una clara discrepancia en la respuesta de la cepa ATCC a los antibióticos utilizados respecto de los test tradicionales de sensibilidad. En el caso de vancomicina, las colonias crecen y se desarrollan de manera normal incluso a concentraciones muy superiores a la CMI, lo que podría explicar posibles fracasos terapéuticos. En el caso de cloxacilina, se observa un fenómeno de “encapsulación” y posterior recrecimiento en presencia de una concentración 4x CMI, lo que podría relacionarse con posibles recidivas.

BIBLIOGRAFÍA. 1) Gómez-Aguado F, Gómez-Lus ML, Corcuera MT, et al. Rev Esp Quimioter 2009;22: 224-7. 2) Gómez-Aguado F, Alou L, Corcuera MT, et al. Microsc Res Tech 2010. DOI:10.1002/jemt.2097.

Palabras clave: Antimicrobianos, colonias, Staphylococcus aureus;

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CUANTIFICACIÓN DE LA INVASIÓN EN AGAR DE ENTEROCOCCUS FAECALIS MEDIANTE ANÁLISIS DE IMAGEN

Autores:
Maria Teresa Corcuera*. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
Fernando Gomez-Aguado. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
M Carmen Ramos. Area Microbiología, Facultad de Medicina UCM. Madrid. España
M Luisa Gómez-Lus. Area Microbiología, Facultad de Medicina UCM. Madrid. España
M. José Alonso. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
José Prieto. Area Microbiología, Facultad de Medicina UCM. Madrid. España

INTRODUCCIÓN

La invasión del agar en medios de cultivo sólidos se ha considerado como un potencial factor de virulencia en levaduras. Recientemente se ha observado este mismo fenómeno en diversas especies bacterianas de interés clínico. La finalidad de este trabajo fue desarrollar un método objetivo para cuantificar la invasión en agar de especies bacterianas mediante análisis de imagen.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se emplearon cuatro cepas de Enterococcus faecalis procedentes de aislados clínicos. A partir de suspensiones de 105 UFC/ml, se sembraron 10 gotas de cinco microlitros de cada cepa sobre Mueller-Hinton y se incubaron durante 4 días a35ºC. Una vez lavadas las placas para eliminar el crecimiento bacteriano sobre el medio de cultivo, el agar se tiñó con azul de metileno al 0.5%. El crecimiento en el interior del agar (huella de invasión) fue visualizado con un microscopio óptico a 50x y fotografiado con una cámara digital acoplada al microscopio. Empleando un sistema de análisis de imagen se desarrolló una aplicación específica para procesar las imágenes correspondientes a las huellas de invasión que permitía cuantificar automáticamente área total y relativa de la invasión, número total de invasiones, número de invasiones por unidad de superficie y área media de cada invasión. Estas medidas se realizaron de manera global y agrupando las invasiones en clases por tamaño. Los resultados se trataron estadísticamente, calculándose la media, desviación estándar y coeficiente de variación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De las variables cuantificadas, los mejores resultados se obtuvieron con el número de invasiones por unidad de superficie, con un coeficiente de variación inferior al 10% en todas las cepas estudiadas y con el área media por invasión, con un coeficiente de variación inferior al 15%. Posiblemente estos parámetros estén en relación directa con el porcentaje de individuos de una población que exhiba el carácter fenotípico “capacidad de invasión del agar” y con la velocidad de crecimiento de esta subpoblación. La metodología aquí descrita permitirá estudiar, por un lado, la relación entre el grado de invasión en agar y la patogenicidad de distintas especies y cepas y, por otro lado, la respuesta de las mismas a los antimicrobianos.

BIBLIOGRAFÍA

Gómez-Aguado, F; Gomez-Lus, ML; Corcuera, MT, et al . Rev Esp Quimioter 2009;22:224-227.

Gómez-Aguado F, Alou L, Corcuera MT, et al. Microsc Res Tech. 2010 Dec 30 [En prensa]. doi: 10.1002/jemt.20977.

Palabras clave: Invasion Enterococcus faecalis; Análisis de imagen;

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INVASIÓN DEL MEDIO SÓLIDO POR BACTERIAS DE INTERÉS CLÍNICO

Autores:
María Teresa Corcuera. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
Fernando Gomez-Aguado*. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
M Luisa Gómez-Lus. Area Microbiología, Facultad de Medicina UCM. Madrid. España
M Carmen Ramos. Area Microbiología, Facultad de Medicina UCM. Madrid. España
M. José Alonso. Unidad de Anatomía Patológica, Hospital Carlos III. Madrid. España
José Prieto. Area Microbiología, Facultad de Medicina UCM. Madrid. España

INTRODUCCIÓN.- Algunos géneros microbianos se describen como invasores del medio sólido (Eikenella, Mycoplasma, Candida, Saccharomyces, Actinobacillus). Esta característica se ha considerado como un potencial factor de virulencia en levaduras. En trabajos recientes sobre arquitectura colonial de especies microbianas con interés clínico, nuestro grupo ha observado este fenómeno con notable frecuencia en colonias de medio y largo plazo de evolución de especies no descritas como invasoras. El objetivo de este trabajo es estandarizar una metodología que permita caracterizar la invasión en medio sólido de especies bacterianas a fin de poder valorar la importancia biológica y clínica de este fenómeno.

MATERIAL Y MÉTODOS.- Se han estudiado un total de 120 cepas procedentes de aislados clínicos correspondientes a Staphylococcus (30 cepas), Enterococcus faecalis (10 cepas), Streptococcus viridans (20 cepas), Streptococcus pneumoniae (10 cepas), Escherichia coli (20 cepas), Salmonella spp (10 cepas), Klebsiella spp (10 cepas) y bacilos Gram (-) no fermentadores (10 cepas). Las cepas se sembraron por triplicado en agar común, agar nutritivo, agar Mueller-Hinton y agar Mueller-Hinton sangre y se incubaron durante 3, 4, 5, 6 y 7 días a 35ºC en aerobiosis. La siembra se realizó en forma de spot, mediante gotas de 3, 5 y 10 μl a partir de suspensiones bacterianas de 105 y 107 UFC/ml. Transcurrido el tiempo de incubación se lavó la superficie de las placas por el método descrito por Roberts y Fink (1994) modificado y se tiñó con azul de metileno al 0.5%. Finalmente, las placas se visualizaron con lupa binocular a 10 aumentos, valorándose la existencia, cantidad y distribución de invasiones. Todas las valoraciones fueron realizadas por dos observadores independientes. La invasión se corroboró en varios controles mediante cortes microscópicos semifinos y teñidos con azul de toluidina.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.- Los mejores resultados se obtuvieron con spot de 5 μl de una suspensión de 105 UFC/ml en agar Mueller-Hinton incubado 4 días. En estas condiciones, todas las cepas invasoras presentaron múltiples puntos de invasión del agar, variables en tamaño y forma (irregular, arborescente, globular, lenticular), dando lugar a una “huella de invasión” característica de cada cepa. Estas huellas permiten definir cuatro patrones semicuantitativos según la intensidad desde (-) cuando no hay invasión hasta 3(+) cuando se percibe una invasión masiva. Según la localización espacial de las invasiones se describieron también tres patrones de distribución: periférico, homogéneo y mixto. En todos los grupos estudiados se identificaron cepas invasoras en porcentaje variable (entre el 13.3% y el 86.6%) excepto Streptococcus pneumoniae que no mostró esta característica en ninguna de las cepas analizadas. La invasión del medio de cultivo, tal y como se define en este trabajo, es un carácter fenotipico variable según especies y cepas, que puede tener cierta relevancia en términos ecológicos y de dinámica de poblaciones. Los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de la existencia de subpoblaciones que portan este carácter justificando así, los distintos patrones de invasión observados. Se plantean interrogantes como: ¿Tiene la invasión importancia en el desarrollo de los biofilm? ¿Es un fenómeno relevante en la patogenia de la infección? ¿Se puede inhibir o seleccionar mediante antimicrobianos? Estudios futuros con técnicas cuantitativas permitirán responder algunos de ellos.

BIBLIOGRAFÍA.- 1) Gómez-Aguado F, Gómez-Lus ML, Corcuera MT, et al. Rev Esp Quimioter 2009; 22: 224-7. 2) Gómez-Aguado F, Alou L, Corcuera MT, et al.Microsc Res Tech 2010. doi:10.1002/jemt.20977.

Palabras clave: Invasion medio sólido; Cuantificación;

 

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